位点特异整合微环dna的体内制备.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３７（７）：８０８７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 技术与方法 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 位点特异整合微环ＤＮＡ的体内制备 １ １，２ １，２ 聂永强 　马海燕 　马晴雯 （１上海交通大学附属儿童医院　 上海市儿童医院　 上海交通大学医学遗传研究所　上海　２０００４０） （２卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室　上海　２０００４０） 摘要　目的：应用诱导表达的ＬＲ克隆酶系统，建立一种在细菌体内获得基于链霉菌噬菌体 Ｃ３１ Ф 整合酶系统的位点特异整合型微环ＤＮＡ的方法，为实现无细菌骨架等冗余序列的转基因奠定基 础。方法：构建包含阿拉伯糖启动子的ＬＲ克隆酶系统和 Ｃ３１整合酶系统的亲本质粒，在 Ｌ阿 Ф 拉伯糖的诱导下重组产生表达 Ｃ３１整合酶的微质粒和包含有目的基因和ａｔｔＢ位点等元件的微 Ф 环ＤＮＡ。以限制性内切核酸酶酶切电泳定性其重组效率，ｑＰＣＲ定量分析微环、微质粒及亲本质 粒的比例，定量计算重组效率。观察随着诱导时间的推进微环／微质粒值的变化。结果：细菌体 内ＬＲ克隆酶系统可有效催化亲本质粒的重组，重组率达８５％以上。相比商品化ＬＲ克隆酶体外 反应具有更高的稳定性而且更经济。结论：获得了一种高效、稳定的细菌体内产生位点特异性整 合型微环ＤＮＡ的亲本质粒。 关键词　微环ＤＮＡ　ＬＲ克隆酶系统　位点特异性整合　阿拉伯糖启动子　 Ｃ３１整合酶 Ф 中图分类号　Ｑ７８ 　　微环ＤＮＡ为非病毒、染色体外的、共价闭合的环 组“假ａｔｔＰ”位点发生高效重组，实现外源基因位点特 ［３］ 状基因表达载体，通常在重组细菌中合成，具有满足临 异性整合 ，且重组反应不可逆，每个细胞往往为单拷 ［１］ ［４］ 床治疗的安全性和长期基因表达所需的简约骨架 。 贝的基因整合 ，可以有效地降低外源基因整合的随 机性和高风险位点整合带来的安全隐患。但 Ｃ３１整 由于微环ＤＮＡ一般不整合入基因组，在静息或活跃分 Ф 裂的细胞中有较高的安全性，亦可实现持续的转基因 合酶系统介导的整合最大的缺点就是整个质粒都会整 表达，因此被认为是一种理想的非病毒载体［２］。虽然 合到细胞基因组中，由此插入了大量的细菌骨架序列。 介导基因转移的病毒型载体通常较非病毒型载体具有 因此，若能制备基于ФＣ３１整合酶系统的微环ＤＮＡ，则 较高的整合效率，但其安全性一直备受担忧；因此，在 有望避免细菌骨架等冗余序列的插入。除了传统的阿 拉伯糖诱导重组酶（如Ｃｒｅ重组酶、ＰａｒＡ解离酶、Ｃ３１ 转基因动物制备中，上述两类载体目前都无法将安全