这种差距说明许多更小的结构细节还没有被人们发现和认识超薄切片.PPT

* * 第二章 医学电子显微学研究方法 第一节 TEM样品制备技术 细胞是生物体结构和功能单位，细胞小结构复杂无色透明，若不借助适当的手段，难以观察，更难发现细胞内各种成份的分子组成和功能，因此研究细胞的技术决定了我们对细胞的认识。许多细胞生物学的重要进展及新概念的形成来自新技术的应用。 在实际应用中电镜图像的分辨率，不仅取决于电镜本身的分辨率,也取决于样品的结构和反差，而样品的结构和反差在很大程度上受到样品制备技术的限制。电镜的分辨率在1.24? ，生物样品最佳制备仅能达到20－30? ，这样远远不能发挥电镜的高分辨性能，这种差距说明许多更小的结构细节还没有被人们发现和认识。 超薄切片技术 Ultrathin Section Techniques 是TEM生物样品制备中最基本的常规技术。它是通过一系列化学方法把组织和细胞制备成树脂包埋块，这种包埋块应具备以下性能： 1、最大限度的保持组织和细胞在生活状态下的结构及形态，保存抗原和酶的活性。 2、切片厚度在50－100nm，具有固定的形状。 3、透光度好，耐电子束轰击。 4、在TEM下树脂不成像，经过电子染色切片具有良好的反差 超薄切片技术是1948年 Pease 和 Barker 二位英国科学家创立的，经过多年的不断发展和改进现已趋于完善。现将样品制备程序归结如下： 超 薄 切 片 制 备 程 序 Preparetion procecture of ultrathin section 取材 细切 预固定 冲洗 后固定 冲洗 脱 水 浸透 包埋 聚合 包埋块 修整 半薄切片 复红和次甲基蓝染色 光 镜定位 超薄切片 电子染色 TEM观察 一、取材 Materail 从动植物机体上，细胞及微生物的培养物中，取得所需材料的过程叫取材。由于生物材料在离开机体或正常的生长环境后，其结构在自溶酶的作用下，容易发生死后变化。为了保持生物材料的原生活状态，取材时应遵守以下原则 1、取材的要求 ⑴ 准确：根据研究的目的和要求，要准确的确定取材的位置⑵ 快速：为了保持生物材料的活体状态，取材速度要块，最好在1－2分钟之内，将所取样品放入固定液中。 ⑶ 样品体积要小：由于固定液的渗透能力弱，四氧化锇的渗透深度为0.25mm，戊二醛的渗透深度为0.5mm。为了保证固定剂能均匀的渗入到样品内，一般要求样品体积不超过2mm3。 ⑷ 低温取材：细胞离体后，细胞内的各种水解酶释放到组织中使构成组织的主要结构，蛋白质、核酸降解造成自溶，为了降低酶的活性，要在0-4℃低温条件下取材保存。 样 品 取 材 示 意 图 ⑸ 防止损伤：取材前要作好准备工作，用铅笔写好标签。取材器具要锋利，动作轻巧，防止挤压造成细胞的损伤。 2、取材的方法 材料来源于，实验动物、手术样品、血液、骨组织、培养细胞和活检材料等。 ⑴ 实验动物材料：将动物用乙醚麻醉后处死，取出所需材料切成长条状，粗细在1.0×1.0×3.0mm3放入固定液中固定30分钟，然后细切成1－2mm3的小块继续固定2小时。4℃存放。 ⑵ 人体组织材料：包括病理活检和尸检材料，这种组织往往带有血液和组织液成份，取材时用生理盐水反复冲洗后再固定。尸检材料一般在低温下保存的组织，争取在死后3－12小时内取材，最长不超过24小时，否则造成细胞膜结构的损伤。 ⑶ 体外培养细胞材料：对生长在培养瓶中的细胞，去掉培养液，放入适量的固定液固定3－5分钟后用刮刀刮下贴壁细胞离心，离心1500－3000转15分钟，使细胞沉淀聚团。 ⑷ 血液材料：取外周血3－5ml，放入加有抗凝剂的试管内，1ml血加抗凝剂0.15ml，离心沉淀1500转15分钟至分层。血清－血小板－白细胞－红细胞，根据所需材料，取不同的分层液，然后加入新鲜的戊二醛离心固定。 抗凝剂的配制 柠檬酸纳 2g 柠檬酸 8g 葡萄糖 24.5g 双蒸水加至 1000ml ⑸、骨组织材料：骨组织比较坚硬，取材时组织块尽可能小一些，放入固定液中固定后在放入脱钙剂中，根据不同部位的骨组织，采用不同的脱钙时间。一般脱钙时间为1－3周，每周更换一次脱钙剂，待骨组织能被针刺进，即为钙盐已经脱好，可以进行常规制样。 脱钙剂的配