红细胞免疫实验所选择的一些测定指标一座谈讲座.pptVIP

红细胞免疫实验所选择的一些测定指标;一、红细胞免疫概述: 二、Ｅ花环率(红细胞的免疫吸附)测定 三、唾液酸(ＳＡ)测定 四、封闭度的测定 五、流动性的测定 六、带3蛋白(band3)测定;红细胞免疫概述; 而对于红细胞免疫检测的方法,从1982年开始,基本建立了红细胞C3b受体和免疫复合物花环实验、单克隆抗体Coombs试验、红细胞SPA花环试验、酵母多糖血凝法、调节因子活性测定及肿瘤血凝法等10余种经典的免疫监测方法。随着对红细胞免疫的进一步深入研究,国内外又建立了测定红细胞C3b受体活体发光法,红细胞膜促白细胞吞噬作用的化学发光法免疫金银染色法,肿瘤细胞血凝法和酶法及直向肿瘤红细胞花环试验等10余种新的方法。这些方法的建立大大促进了红细胞免疫的基础理论和临床研究的进展。;肿瘤细胞兰色,红细胞红色,一个肿瘤细胞结合3个以上红细胞为肿瘤红细胞花环。 计算花环率。 需要注意的问题: 1 小鼠取血前最好禁食不禁水12h,才能取出较多的血。 2 人的新鲜血液一定要保持新鲜,才能成为血清致敏癌细胞。 3 瑞士染色剂最好在一个月以前就配置好,最好是保存三个月以上。 4 查Ｅ花环时一定要查准。 ;唾液酸(ＳＡ) ;有研究表明,唾液酸转移酶与肿瘤转移密切相关。细胞膜表面唾液酸含量与肿瘤的恶性程度有关,发现随着肿瘤的生长,红细胞膜上的唾液酸含量增加。红细胞中的唾液酸主要存在红细胞膜上,唾液酸含量增多,可影响红细胞膜(RBC)表面电荷磁性,膜的转运物质过程、抗原决定簇的暴露、免疫应答细胞活性、膜表面受体功能等因素。 ;一些抗癌药物可抑制唾液酸转移酶活性,减少细胞表面唾液酸含量,显著降低肺癌转移的结节散,使小鼠的生存时间延长。在大鼠试验中,它们能抑制大肠癌的肝转移。其作用机制不是直接作用于癌细胞,而是通过抑制唾液酸转移酶,诱导细胞表面糖链结构改变,从而影响癌细胞与正常细胞的相互作用。综上所述,抑制唾液酸转移酶,降低癌细胞表面唾液酸含量,是某些抗转移药物的主要机制之一。;实验所需要的药品及仪器: 蛋白酶水解抑制剂对甲苯磺酰胺(PMSF)(Sigma公司);考马斯亮蓝CBBG250(南京建成生物工程研究所);蛋白标准品(南京建成生物工程研??所);唾液酸标准品(浓度(南京建成生物工程研究所);5-甲基苯二酚(南京建成生物工程研究所)。 仪器 :离心机(北京医用离心机厂);低温高速离心机(BECKMAN AvantiTM68 centrifuge);电热恒温水浴锅(北京长安科学仪器厂);751分光光度计(上海第三仪器厂);　 　测定方法: 取全血离心,3000转/分,10分钟,1:3生理盐水洗涤2次,1:1悬浮在生理盐水中制成红细胞悬液;加入5p 8.4磷酸缓冲溶液(1:30) 4℃ 1小时溶血使成为红细胞溶血液.然后4℃下离心,12000g,40分钟,弃上清液,5p8.4磷酸缓冲液洗涤3次,最后悬浮在一定量5p8.4磷酸缓冲液中。制成为影泡悬浮液。;膜蛋白定量 使用试剂盒: 按要求处理完后混匀,静止10分钟,于595 nm波长处,空白管调零后,测各管吸光度。蛋白含量(mg/ml)=(测定管OD值/标准管OD值)×标准管浓度(mg/ml)根据原始蛋白浓度值,将样品最终稀释至1 mg/ml,放置低温冰箱备用。 SA测定也按照试剂盒要求操作,然后混匀,100℃水浴15分钟,流水冷却后,3000转/分,离心10分钟,取上清,于560 nm波长处,空白管调零读取各管吸光度。 数据处理 用SPSS11.0软件处理。各组数据以±s表示,样本比较采用方差检验。; 　需要注意的问题: 1 本实验的重点在于溶血步骤,一定要用生理盐水充分将红细胞洗干净,再用低渗溶液破膜。且最好过夜。 2 本实验要在低温离心机下进行。一定要注意始终保持4℃左右的温度 3 本实验过程中的蛋白定量一定要作准,才有可能进行下面的实验。;封闭度;实验所需要的药品及仪器: 蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)(Sigma);考马斯亮兰CBBG250(南京建成生物工程研究所);白皂素; K3Fe(CN)6 。 751分光光度计;低速离心机(北京离心机厂);低温高速离心机(BECKMAN);超净工作台;光学显微镜。;测定方法: 红细胞封闭影泡的制备 :先制备不封闭影泡,方法同前。然后用等渗磷酸缓冲液将不封闭影泡洗涤一次,2000转/分,离心10分钟,接着将洗过的影泡放在等渗溶液中,37℃保温1小时即获得封闭影泡。 NADH－细胞色素C氧化还原酶活性的测定:取膜样品(膜液)0.6ml于比色杯中,按要求加反应液,混匀后在波长420nm处比色,以加入NADH为起点,记录反应开始6分钟内的OD值(每隔1分钟记录一次)。上述反应在室温(25℃)进行。比色对照,除不加NADH溶液外其他操作同上。; 数据