基因工程的工具酶学习研究.pptVIP

基因工程的工具酶;;;核酸酶的分类： 1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）、DNA酶（Dnase）和底物非专一性核酸酶； 2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）和外切核酸酶（exonuclease）； 3) 根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）和非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性） ; 用于核酸操作的工具酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;; 限制性核酸内切酶的切割类型： （1）两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段； （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。 ;EcoRⅠ等产生的5’粘性末端;PstⅠ等产生的3’粘性末端;PvuⅡ等产生的平头末端;3.病毒性肺炎 如冠状病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。 　　4.真菌性肺炎 如白念珠菌、曲霉、放射菌等。 　　5.其它病原体所致的肺炎 如立克次体、弓形虫、原虫、寄生虫如肺包虫、肺吸虫、肺血吸虫）等。机体免疫力低下者（如艾滋病患者）容易伴发肺部卡氏肺包子虫、军团菌、鸟形分支杆菌、结核菌、弓形体等感染。 　　6.理化因素所致的肺炎 如放射性肺炎、胃酸吸入、药物等引起的化学性肺炎等。 　　7.支原体肺炎 由肺炎支气体引起。 编辑本段发病原因 ?? 肺炎 　　患肺炎的原因可能是：接触到一些厉害的病菌或病毒身体抵抗力弱， 如长期吸烟。上呼吸道感染时，没有正确处理。例如是没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多（Sputum retention)。 　　如果一年内有多过一次真正的肺炎 （一些医生误看X光片或滥用了肺炎的诊断)，原因可能是：身体抵抗力弱 （先天性或后天性) 气管有异物。尤其是幼童。 心肺有其它病变：如癌病、气管扩张、肺尘埃沉着病、没有正确地看医生、没有正确地看服药，又或者是滥用止咳药止咳以至痰和菌愈积愈多（Sputum retention) 工作环境有问题。注意改善空气流通、冷气系统。 ;位点偏爱（site preference） 某些限制性??切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。 ;星号活性（star activity） 又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如酶浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。 ;同裂酶 (isoschizomers) 有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。 例如，XmaI（C CCGG G） SmaI（CCC GGG） ;;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;影响限制性核酸内切酶活性的因素;限制性核酸内切酶;酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子，通常是Mg2+ 。 缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.5的条件下，其功能最佳。 巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。 ;影响限制性核酸内切酶活性的因素 酶切消化反应的温度 大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况。 ;限制性内切酶反应的终止 消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。但有些酶，如BamH I和HaeⅡ具备对热稳定性，则需加入终止反应液（加入0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L 以螯合Mg2+）。 ;限制性核酸内切酶的特点;限制性核酸内切酶的应用;利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤： 不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此，所以建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。 以下是对0.2—1.0 ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。;1) 加入合适体积的DNA溶液； 2) 加入2ul适当的10X限制酶消化缓冲液，轻敲管外壁以混匀之； 3) 加入1－2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之； 4) 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育； 5) 加入0.5M/L EDTA