制备型HPLC--田徽 - 液相色谱基础.ppt

第十一章 制备型HPLC 第一节 高效液相色谱知识基础 色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器 常见的分离方式： 蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等 色谱法简介 色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学家1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography 30年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代 色谱的发明人 俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献 色谱分离的机理 什么是液相色谱 什么是高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段 HPLC的仪器配置及流程 HPLC的仪器配置及流程 色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram） 液相色谱原理 － 基本概念及方法开发 液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件 评价液相色谱方法的标准 什么是色谱的分离度 影响分离度的因素：K’、α及N 分离度方程： K‘ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 α是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度 α、k’ 及 N 如何控制分离度 高效液相色谱按目的不同分为两类 分析型液相色谱 制备型液相色谱 液相色谱应用：分析型液相色谱 定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用 分析型液相色谱仪 Agilent1100液相色谱仪 液相色谱应用：制备型液相色谱 分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求 化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性 分析和制备的目的不同： 分析液相的目的是给一种组份进行定量和定性。 制备液相的目的是对单体产品进行提取和纯化。 产品纯度 处理量 回收率 生产时间 分析系统的成倍放大 直径更大的制备柱 更高的流速 增加进样量并保持样品浓度不变。 这种方法需要大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品，因此这种方法是不适用于制备。 色谱柱超载进样 色谱柱超载进样可以通过两种方法进行 浓缩法 体积超载法。 如果样品组份的溶解性很差，浓缩法超载进样不能使用。 通过将更多的样品体积注射到色谱柱中，这种技术称作体积法超载进样。 二、分析HPLC到制备型HPLC方法的合理放大 在分析液相中色谱柱的在这种条件，峰形尖锐并且很对称。 在制备液相中，最大的区别就是超量进样。以实现分离效率的最大化。 样品负载是制备型HPLC的主要目标 如果将超过一定量的样品注射进色谱柱，吸附变化线就会成非线性。 这意味着峰形会变的不再对称，表现为严重的拖尾和容量因子的缩小。在制备液相中，这种效果称作浓缩超量进样。 因为超载进样会提高一次运行中所分离的样品量，因此从分析方法到制备方法的放大和方法的优化需要三个步骤。 1. 优化分析方法的选择性。 2. 在分析柱上进行超载进样。 3. 放大到制备柱。 三、制备型高效液相参数的平衡 在实际应用中，每个参数的重要性都是不同的。 为了进行活性或药物测试，某种组份必须被完全单独提取时？ 某种合成中间体必须被纯化，并且需要有足够的量为下一步合成作准备时？ 一般说来，纯化的成本要高于生产粗产品的成本 所以，可以加大上样量，甚至过载，出现平头峰，而收集只集中在峰的一小部分，以来保证纯度，主要为了节省流动相和提高设备利用率。 第三节 实验技术与操作 制备色谱，要解决容量与柱子效果之间的矛盾，对重现性也要考虑。从经济上来说。制备色谱要争取少用填料，少用溶剂，要尽可能多的得到产品。 样品的前处理 前处理的必要性。 萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用以去掉杂质。