基因芯片的制作.ppt

* * 基因芯片的制作 基因芯片技术流程 制备方法及点样仪器 探针的制备：标记方法 杂交：杂交液、杂交温度、 洗涤条件的选择 扫描仪:激光 CCD 分析软件的开发 基因芯片的制备 杂交 检测 数据分析 芯片的制备 原位合成 高密度（可达40万点/1.6平方厘米） 25bp ONA 测序分析，寻找点突变 (Hyseq专利保护) 微量点样（针点、喷墨〕 较高密度（可达10万点/6.5平方厘米） 500~5000bp DNA、抗体抗原、受体药物等 对比分析 数据分析、寻找差异表达的基因 靶基因 Cy3标记A组织 Cy5标记B组织 混合探针 以两种波长的激光扫描 杂交 A B 杂交实验条件 探针的制备 标记方法 PCR 逆转录 随机引物 缺口翻译 标记物 同位素 荧光染料 化学发光 杂交 杂交体积(使核酸浓度增加 10万倍） 玻片: 2-200?l 滤膜：5-50ml 杂交液和杂交液的组份 杂交温度、时间 洗涤条件 洗涤液的组成 洗涤的温度、时间 （探针A + 探针 B） 混合探针 95 ℃变性 95 ℃变性 42 ℃ 15hrs 杂交 洗片试剂1、2、3 洗涤 543nm扫描 633nm扫描 检 测 扫描仪 激光共聚焦扫描 光源：特定波长的光 激发面积：100平方微米 如：ScanArray 3000 CCD 成像术 光源：连续波长的光（如弧光灯） 激发面积：同时激发多个1平方厘米的面积 Detector Confocal pinhole Filter Laser beam Substrate Objective lens Detector lens 激光共聚焦扫描仪的扫描原理 注 意 事 项 1.整个试验过程建议戴乳胶手套操作,避免带入荧光杂质 ; 2.染料储存应避光 储存; 3. 用于标记的 总RNA OD260/OD280在 1.8-2.0之间,电泳 18s和28s条带清晰, 无DNA杂带; 4.标记过程中尽量避免RNA酶污染样品; 5.步骤（3）至（5）需在暗室中（可配有红灯照明）进行; 6.杂交及预杂交过程加盖玻片时不能留气泡，杂交体系不能干掉; 7.芯片上贴标签部分整个实验过程中避免碰到液体; 8.用洗片试剂洗涤芯片并将盖玻片冲洗掉的过程中尽量避免 直接 对基因点样区直接洗涤, 应尽可能让液体从其上方温和均匀地流过点样区。 9.洗片试剂2如有沉淀, 可40°C 温浴至澄清后使用。 异常结果的几种可能性分析 现 象 可能原因 扫描图谱空白 ｍRNA降解 反转录酶失效或标记效率低 背景过高或显色不均匀 mRNA不纯 杂交或预杂交时芯片干掉 洗片不彻底 冲洗时用力过大损及点样区 出现不规则的小点 空气或洗液中的杂质污染 （面积小于点样点） 影响实验结果的关键因素 Total RNA 的制备 mRNA 质与量 RNase free 避光