基因测序实验常见问题分析讲解说明.ppt

三、基因分型时出现的问题 分析及解答：从图1可以看出，在样本的每个位点上都有两个或两个以上的目的峰，并且目的峰之间峰值很不均衡，这些都说明这是一个混合样本。等位基因间峰值不均衡是因为不同来源的模板浓度不同导致。如果样本实际上应该是单一来源的，则说明在DNA提取或扩增的过程中污染了其它的DNA，需重新提取DNA或扩增。 1. 有额外的杂峰，并且每个位点均有杂峰 2. 只在一个位点或几个位点出现了额外的杂峰 分析及解答：图中，D21位点明显污染了ladder，这可能是由于检测过程中污染了D21 ladder的片段 3.在个别位点出现的不同于目的峰的染料堆积峰 偶尔会在本实验室出现的染料堆积峰（vWA位点、D18位点附近） 4. 峰值过高 5. pull-up或pull-down峰 分析及解答：当峰值过高（大于4000rfu）或matrix校正不好时，都可能会观察到在某一颜色中出现由另一颜色的信号而拉起（pull-up）或减低（pull-down）的峰。如果峰值过高，可以在上样前先将PCR产物进行稀释，这样电泳时峰值就会下降，pull-up或pull-down峰就会减轻。如果峰值小于2000rfu还是出现pull-up或pull-down峰，则说明是matrix校正不好，需要重新进行校正。 6. 位点丢失 分析及解答：图中出现了明显的位点丢失现象，这是由模板量较低或模板已降解造成的，DNA降解成为较小的片段，故相对长些的片段无法得到扩增； 7. 峰值低，影响分型 分析及解答：峰值较低，可能是模板DNA的量不足，或者是模板DNA中存在较多的抑制剂，而样本中较多的离子或EDTA都会影响PCR扩增的效率。此时可以增加模板的用量，增加反应的循环数。但要注意的是，模板DNA的体积不要超过总反应体积的20%，否则其中的抑制剂会抑制扩增反应。 8. 小片段位点优势扩增而大片段位点扩增效率低 分析及解答：图中是一个明显的小片段优势扩增而大片段扩增效率低的图例。这种现象经常见于含量过大的DNA模板（ABI的ID试剂盒此种现象更为明显），可能是因为当模板过多时，体系中的聚合酶，dNTP等资源被小分子量片段（因其较易扩增）优先利用，而大分子量的片段得不到足够的资源来高效扩增而导致的。若想改善这种状况可以适当减少模板的用量，并降低反应的循环数。 9. 等位基因峰高失衡 分析及解答：图中峰值很低，等位基因间峰高失衡，以至于难以判型。当模板量过少时，得到的PCR产物较少，等位基因与噪音峰在峰值上相差不多，无法判断是等位基因型还是噪音峰，导致无法准确判型。 基点认知技术（北京）有限公司 基点认知技术（北京）有限公司 技术支持部 实验常见问题解析 出现问题的类型 光谱校正时出现的问题 电泳时出现的问题 基因分型时出现的问题 其它在出差中遇到的问题 一、光谱校正时出现的问题 1. 软件提示： Insufficient number of dye spectra detected! Check raw data... （1） 实际原因：泳道没有收集到信号，即没有检测到目的峰，或目的峰信号过低，低于750rfu。 解决方案：如有必要重新校正则减少与甲酰胺的比例，或增大进样时间。 5. 选择了不适合Dye set的Module 二、电泳时出现的问题 1.所有毛细管没有数据 原因：毛细管或block通路中有气泡 没有样品进入 自动进样器不在正确位置，使毛细管头吸入气 泡或接触不到样品 措施：重新正确上样，排气泡，拆毛细管清洗block，syring，更换胶 2.个别毛细管无信号 原因：自动进样器不在正确位置（用20μl 样品试验） 样品管是中空的（离心） 毛细管有弯曲或有损坏（更换毛细管） 3. 信号过饱和 原因：上样量过大（稀释样品，减少进样时间） 4. 信号过低 表现为信号很弱，内标只有几十rfu。 原因：甲酰胺质量不高 使用的水中盐离子浓度过高（更换超纯水） 没有足够的样品（增加上样量，校正自动进样器） 样品稀释倍数过大 混合的不充分（充分混合，离心） 自动进样器不在最佳位置 5. 基线不平，峰形明显异常 原因：胶中可能有污染物（清洗block，syring，更换胶） 胶中有结晶或沉淀物（将胶在室温放置30min使之达到室温，旋动使沉淀物溶解） 光谱校正的不好 6.信号凌乱，有倒峰 原因：所选的dye set不适合 光谱校正的不