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结核病实验室诊断技术 刘丹 阳文华 邵阳市疾病预防控制中心痰涂片实验室 Robert Koch Mycobacterium tuberculosis 结核分枝杆菌H37Rv全基因组大小为4 411 529bp，G+C含量为65.6%，基因组富含重复序列，特别是插入序列，以及新的多基因家族及管家基因，10kb以上的高G+C区域，即PE/PPE区域。整个基因组中G+C含量相对稳定 细胞壁富含长链脂肪酸，68%~70% 分枝杆菌生物学特性 结核分枝杆菌是专性需氧菌，不形成芽孢、无动力的杆菌，空气中加入5%~10% CO2会刺激其生长。最适pH为6.4~7.0。在35℃~40℃均可生长，最适宜温度是37℃，但牛分枝杆菌最适宜温度为36±1℃。生长缓慢，固体培养基上生长，代时为18h~20h，形成肉眼可见的菌落一般需要8天-8周；但液体培养基上稍快，代时为14h~15h。 分枝杆菌细胞壁中的脂肪成分不能被常用的苯胺染料着色。虽然革兰氏染色法很难使分枝杆菌着色，但它仍归类为革兰氏阳性菌，特定的染色程序可促进染色；一旦着色，分枝杆菌则很难脱色，即使是使用酸性乙醇也很难使分枝杆菌脱色，这一特性被定义为抗酸性（acid-fastness）。 结核分枝杆菌的抵抗力 结核菌对干燥或干热、冷冻抵抗力强； 对热敏感，60℃ 10~30分钟、80℃以上5分钟以内死亡。 对紫外线敏感，太阳光直射，2~7小时死亡，紫外线10W 50厘米，5毫米厚度的菌悬液（10-1mg/ml）照射3分钟，可灭菌。结核病人的衣物、被褥、用品等可煮沸、或日光消毒。 对大多数消毒剂敏感，75%乙醇5分钟（可用于手消毒，但不能用于痰消毒，因为乙醇能凝固蛋白质）、0.1%升汞液10分钟、1%~2%石炭酸5分钟，5%石炭酸1分钟，2%来苏儿液5分钟，0.1%~1%过氧乙酸1~小时，均可杀灭结核杆菌。121℃高压20~60分钟，可灭菌。 Evolution of the Mycobacterium tuberculosis complex From Brosch et al. PNAS 2002 M. canettii 实验室检测的标本 绝大多数做分枝杆菌培养的标本来自呼吸道：痰、盥洗液 组织、胸水、腹水、尿液和胃液也是常用的标本。 血和粪便标本多来自AIDS患者。 关键点：采集合格的标本 病原检测、鉴定技术及应用 涂片染色显微镜检查 细菌培养 固体培养、液体培养（常规、快速） 常规培养生化鉴定 分枝杆菌鉴定系统 分枝生物学鉴定技术 多位点PCR鉴定，PCR-RLFP IS6100-RLFP, Spoligotyping，MLVA 应用 病原学诊断 病原学监测 暴发流行的病原调查和溯源 涂片染色显微镜检查 病原检测、鉴定技术及应用-1 荧光染色技术 抗酸染色技术 三、病原检测、鉴定技术-2 细菌培养 固体培养 液体培养 BACTEC MGIT960 常规培养生化鉴定 耐热触酶试验 堪萨斯分枝杆菌（+），结核分枝杆菌（-） 硝酸盐还原试验 结核分枝杆菌（+），牛分枝杆菌（-） 吐温-80水解试验 堪萨斯分枝杆菌（+），瘰疬分枝杆菌（-） 尿素酶试验试剂 结核分枝杆菌（+），蟾蜍分枝杆菌（-） 芳香硫磺酯酶试验 偶然分枝杆菌（+），结核分枝杆菌（-） 铁离子吸收试验 偶然分枝杆菌（+），龟分枝杆菌（-） 亚碲酸盐还原试验 胞内分枝杆菌（+），次要分枝杆菌（-） 烟酸试验 结核分枝杆菌（+），牛分枝杆菌（-） 病原检测、鉴定技术及应用-3 PNB、TCH鉴别培养基鉴定 病原检测、鉴定技术-4 分枝生物学鉴定技术 多位点PCR 病原检测、鉴定技术-5 分枝生物学鉴定技术PCR-RLFP 病原检测、鉴定技术-6 标准菌株 Hsp65-PCR rpoB-PCR RFLP 测序 HaeⅢ BstpI HaeⅢ MspI BLAST 模拟酶切 注：先用两种基因进行酶切，进行指纹图谱分析，仍然无法鉴定出的进行测序，在NCBI数据库上进行比对。 分枝生物学鉴定技术 IS6110-RLFP 病原检测、鉴定技术-7 结核分枝杆菌全基因组DNA pvuII 酶切产物 IS6110-RFLP分析内对照标准分子 结核分枝杆菌IS6110-RFLP结果 结核分枝杆菌聚类分析树状图 分枝生物学鉴定技术 Spoligo