流式细胞技术及其在科研中的应用.ppt

课程内容 第一部分 概要 第二部分 仪器构造及工作原理 第三部分 技术及方法 第四部分 应用 §1.1 基本概念 流式细胞技术（Flow Cytometry, FCM） 是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。(荧光显微镜技术的改良) 流式细胞仪（Flow Cytometor, FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。 又称 (Fluorecence activated cell sorter, FACS) FACSort FACSCalibur FACSVantage §1.2 技术特点 单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制成单细胞悬液。 快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。 §1.2 技术特点 多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数等更为准确。 定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。 第二部分 仪器构造及工作原理 §2.1 仪器构造 1. 流动室及液流驱动系统 2. 激光光源及光束形成系统 3. 光学系统 4. 信号检测与存贮、显示、分析系统 5. 细胞分选系统  §2.2 工作原理 1. 流动室 仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔 径为430×180um长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心。 流动室内充满鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 §2.2 工作原理 2. 激光光源 目前FCM大多采用氩离子气体激光器，波长为488nm。激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。用聚焦透镜对激光光束聚焦后，可以在照射区得到一个近似扁平的椭圆形光斑，其厚度可达20μm。当流动的细胞经过光斑时才能被激光照射并产生光散射和发射荧光。 §2.2 工作原理 3. 光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。 §2.2 工作原理 4. 信号检测 （1）散射光信号 前向角散射(Forward Scatter, FSC ) 　侧向角散射(Side Scatter, SSC) （2）荧光信号 FL1、 FL2、 FL3、 FL4 前向角散射光（FSC） 侧向角散射光（SSC） §2.2 工作原理 5. 数据的存贮、显示与分析 FCM数据存贮的方式均采用列表排队方式。 数据的显示通常有一维直方图、二维点图等。 　 §2.3 细胞分选原理 当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方的压电晶体产生机械振动带动流动室以相同频率进行振动，使液流注断裂成一连串均匀的液滴，仅少量液滴含有细胞，有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了被分选的细胞的特性参数时， 此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左的偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目的。 §3.1 荧光探针的选择 常用荧光染料的特性 荧光染料 分子量 激发波长(nm) 发射波长(nm) 颜色 用途 FITC 390 488 525 深蓝 免疫荧光 PE 240000 488 575 橙色