脑内微透析采样技术.pptVIP

脑内微透析采样技术 前言 神经元之间的信息传递主要以递质分子的释放、识别和灭活为基础。神经细胞间隙是神经元之间信息的主要部位，它含有传递信息所需的各种神经递质和调质以及其代谢产物，以及一些其它的生物活性物质或前体物质。要了解神经元之间信息传递过程，观察诸如学习、记忆、感觉、运动控制等脑高级神经活动引起的化学变化，必须对神经细胞间隙中的化学物质进行动态检测。 原理 脑内微透析技术以小分子和水能通过半透膜顺浓度梯度进行扩散的原理为基础，将管状微透析膜植入脑内特定区域，用组份类似于脑内细胞外液的溶液持续灌流，当某些物质的浓度在透析膜的一侧较高时，这些物质分子就会顺浓度梯度进行扩散，进入或者流出透析管。由于灌流连续不断的进行，透析管内的液体不断的流动更新，因此跨膜的浓度梯度始终存在，这就构成了物质分子不断地在脑内环境和透析管之间扩散的基础。 透析探头 所有的透析探头均由透析膜（管）与入液管和出液管连接而成。按照连接的方式，可将透析探头分为两大类： 入液管和出液管以串行的方式与透析膜连接，即水平式。 入液管和出液管以并行的方式与透析膜连接，即垂直式。 透析探头 水平式探头主要运用“横穿脑”脑技术植入脑内。透析管除了透析部分外，表面用一种不通透如环氧树脂封闭。此法优点在于简便易行，探头一旦植入即可随动物移动。其缺点在于植入过程中要在出入口各打一洞，引起所经过脑区，颅骨及肌肉产生过多的损伤。 透析探头 垂直式探头通过立体定向仪能准确定位到所需测定的脑区，这类探头可分为环型、并列型和同心型等。同心型探头目前最流行，这种探头采用管内套管的设计，可以制作直径小，适合于通过预先埋置引导管插入组织，为慢性实验提供方便。 灌流液 进行脑微透析实验时，使用的灌流液中各离子组份的浓度应与脑内细胞外液保持一致。Ca2+的浓度对实验结果成败极为关键，目前认为细胞外Ca2+浓度估计值1.2mM。实验室常用的灌流液浓度为，NaCL 140mM、KCl 2.4mM、MgCL2 1.0mM、CaCL2 1.2mM 、NaHCO3 5.0mM、Ascorbic acid 0.6mM （pH7.4）。 样品收集 透析实验使用的灌流速度一般不超过5~10μl/min。因为高流速并不能进一步增加物质跨膜流量（绝对回收率），而且灌流液在压力下流出探头可能会引起组织损伤。灌流开始时，回收率较高，一般认为，这是探头插入所引起的伤害性组织反应。一般经过30~60 min后，回收率基本趋于稳定。 样品检测 透析样品可直接用HPLC-电化学/荧光/紫外检测技术或其他高灵敏度微量化学分析法测定。对于某些含量极低的物质，可增加回收率的方法来弥补灵敏度的不足。如可加长透析膜的有效长度、改变灌流速度，也可使用药方法（如在灌流液中添加摄取阻断剂）以提高待测物质含量。 微量采样的定量方法 在微透析实验中，我们通常关心的是药物或行为操作所引起的神经递质释放的变化，这种变化可以用相对于基础浓度的百分数表示。也可以通过计算透析回收率，将透析液中物质的浓度转换成脑内细胞外的实际浓度。 微透析与传统的灌流方法相比具有： 由于灌流液并不直接与脑组织接触，其对脑组织损害较小。 微透析样品通过透析膜过滤而得到，样品避免受到大分子物质如蛋白质、酶类等污染，透析样品可直接进样测试。 可以进行清醒动物微透析实验，有利于观察行为与化学物质变化的关系。 数据有效性判定 对TTX的敏感性 TTX是一种神经毒素，能够阻断Na+通道，抑制神经元的电活动，减少神经递质的释放。根据文献报道，TTX对DA，5-HT等这类递质的释放有较高的敏感性。而对氨基酸如谷基酸、牛磺酸等物质的释放无效。 对Ca2+的依赖性 Ca2+的内流与神经递质的释放有密切的关联，降低细胞外Ca2+浓度能抑制突触神经递质的释放。实验发现用不含Ca2+的Ringers液灌流发现灌流液中递质如DA、5-HT、Ach、NA等释放逐渐消失。 对高K+的影响 高K+能诱导神经元产生去极化进而释放神经递质增加，研究发现当灌流液中K+浓度由30mM增加到100mM，灌流液中DA、5-HT、Ach、NA等释放迅速增加。同时发现氨基酸类物质释放也增加。 应用脑电刺激的影响 通过电刺激脑内神经投射通路促进神经递质的释放。 吗啡戒断大鼠蓝斑核兴奋性氨基酸变化 蓝斑与阿片躯体戒断关系密切。蓝斑核位于第四脑室底部，是主要由去甲肾上腺素能神经元组成的神经核团。蓝斑核接受脑内广泛的神经纤维的投射（5-HT、EAA、Ach、阿片肽等），同时发出NA纤维到许多脑区。 NMDA↑---NO↑——cGMP↑——Glu↑、Asp↑——蓝斑核↑ * * 顾 钧