猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒基因工程疫苗研究教学教程.pptVIP

肖少波 华中农业大学动物病毒室;猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称兰耳病 1987年首次暴发于美国北卡罗纳州——“神秘病”，导致至少100万头猪死亡 1991年，PRRS席卷欧洲大陆 1996年，PRRS在我国首次爆发；同年，丹麦再次暴发PRRS，全国40-50%的母猪出现流产、死胎和断奶前仔猪的大量死亡 2000年，美国再次大爆发PRRS，并将其列为当前最严重的猪病毒性传染病 目前，PRRS遍及世界养猪国，并呈流行态势;猪繁殖与呼吸综合征的危害;蓝耳病流行新动向;能保护猪不出现临床症状，但不能阻止强毒感染。 只适合3-18周龄的猪和非孕母猪使用。 存在散毒问题和返强性，并且返强的几率相当高（可达30%)。;丹麦事件的教训：丹麦1996年7月使用美洲型PRRS弱毒疫苗免疫后，1996年底至1997年初出现了PRRS的多次大暴发，全国40-50%的母猪出现流产、死胎和断奶前仔猪的大量死亡。病毒分离与全基因组序列分析证实是由疫苗株引起的(Masden et al,1998;Botner et al,2000) 与疫苗株同源性高达98%以上的强毒株越来越多 目前，许多国家已禁止使用弱毒苗。;较弱毒苗安全，但产生的保护力不强，需要反复多次的免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。 疫苗安全性与有效性的矛盾以及目前尚无更好的疫苗使PRRS的免疫预防处于一种两难境况。 迫切需要更安全、高效、廉价的新型疫苗;GP5 \E(ORF5);亚单位疫苗 DNA疫苗 腺病毒载体疫苗 伪狂犬病毒载体疫苗;GP5基因的修饰;表达修饰的ORF5m基因的DNA疫苗;ELISA抗体（小鼠）;中和抗体（小鼠）;细胞免疫（小鼠）;修饰型ORF5m基因具有更强的免疫原性，有希望成为新一代疫苗候选基因。 ;ORF5与ORF6基因共表达DNA疫苗;kDa;ORF5/ORF6双基因共表达对GP5和M蛋白的亚细胞定位的影响;GP5 (mut4EGFP);ORF5/ORF6双基因共表达显著增强中和抗体;GP5和M蛋白共表达较单独表达所产生的细胞免疫应答显著增强，同时联合免疫也表现出一定程度的提高。;研究表明： 1. 体外表达的GP5蛋白可以与M蛋白通过二硫健形成异源二聚体，并且这种二聚体的形成有利于GP5蛋白从内质网向高尔基体的转运，有利于免疫提呈的增强，提高免疫应答。 2. GP5-M异源二聚体形成的几率和多少与免疫反应的强弱具有正相关性。;ORF5m与ORF6基因共表达DNA疫苗; SN titers Times Groups;ORF5m与ORF6基因共表达增强细胞免疫;PRRSV新一代疫苗设计;PRV-PRRSV重组病毒构建流程图;RV5: TK-/gE-/GP5+ RV56: TK-/gE-/GP5+/M+ RV5m：TK-/gE-/GP5m+ RV5m6:TK-/gE-/GP5m+/M+ ;重组病毒免疫小鼠后的PRV中和抗体;重组病毒免疫小鼠对PRV的免疫保护;;重组病毒免疫小鼠后均能产生特异性的淋巴细胞增殖反应。 以修饰的GP5m基因构建的重组病毒均能显著提高特异性细胞免疫反应，其中以TK-/gE-/GP5m+/M+最为明显。;重组疫苗对猪的免疫反应与攻毒保护;重组疫苗产生的针对PRV的抗体;PRRSV中和抗体检测;针对PRRSV的细胞免疫反应;攻毒后体温变化;攻毒后的病毒血症和排毒;肺部组织病理变化;肺门淋巴结病理变化;? Groups ; 研究表明： 以伪狂犬病毒为载体共表达修饰的GP5m和M蛋白的重组疫苗能够同时诱发较强的针对PRV和PRRSV的免疫应答，具有较好的免疫保护，有望成为新一代安全、高效的PRRSV新型疫苗。 临床初步应用： 免疫预防 对发病猪的紧急接种 ;进一步对ORF5基因进行修饰，目前已获得18个突变体，其中对ORF5进行糖基化修饰后的突变体ORF5/34-/51-较天然的GP5产生的中和抗体高100倍。 构建伪狂犬病-蓝耳病-圆环病毒-猪瘟的四价基因工程疫苗。;“自杀性”DNA疫苗;PRRSV“自杀性” DNA疫苗; SN titers Times Groups;免疫猪后诱导的细胞免疫;pSFV-5m6/RV5m6免疫猪后PRRSV中和抗体;PBMC的淋巴细胞增殖;攻毒后体温变化;病毒血症和排毒;本研究由国家“973”基础研究、国家“863”和国家自然科学基金资助