植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增座谈讲座.pptVIP

* 植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增 1、植物基因组DNA的分离纯化 一、实验原理 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA是双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器 DNA为双链环状分子，有些噬菌体DNA有时为单链环状分子。95%的真核生物DNA 主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。 从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核 糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。 盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时，通常是用研磨破坏细胞壁和 细胞膜，使核蛋白被释放出来。利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶 于0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞 液中分开。 分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有 3种：① 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除 去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而 DNA则溶于上层水相，用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。② 用 十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可 从材料中直接提取出DNA。③ 用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNA 与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内， 吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复 使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去， 得到较纯的DNA制品。本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA杂质，可用RNA酶进行处理。另外， 生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖，这些物质在用盐溶液分离核蛋白 和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。 核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑 制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物 质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除RNA 分子污染。 操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种 有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般pH4- 10；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。 提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂 类分子，去除RNA，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体 的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。 二、仪器设备 高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱 三、材料及试剂 1. 材料：水稻幼苗 2. 试剂： ① 2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L EDTA、0.2%?-巯 基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)：取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2ml?-巯基乙醇， 加双蒸水(ddH2O)定容到100ml； ② 氯仿:异戊醇(24:1) ③ 洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：取70mL无水乙醇和0.077g 乙酸铵，加双蒸水定容到100ml； ④ 无水乙醇、70%乙醇； ⑤ TE缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0 2、 RAPD技术在生产上的应用-杂交水稻种子纯度的鉴定(RAPD 扩增) 一、实验原理 传统的种子纯度鉴定主要有田间鉴定法和实验室鉴定法。 实验室鉴定种子纯度主要依据种子的物理、化学及生理特性 等。但随着生物化学及分子生物学技术的迅速发展，种子纯度 鉴定技术产生了质的飞跃，现代生物化学和分子生物学技术被 成功地引入到种子纯度的鉴定中，如蛋白质电泳和分子标记 等。 分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。广 义的分子标记包括同工酶标记和DNA标记，狭义的分子标记仅指 DNA标记。DNA标记主要有：1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 即限制性片断长度多态性)。它是由于核 酸序列不同而造成的DNA限制性片断之间产生等位基因差异的结 果。 2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)。3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段