第1章抗体制备技术.PDF

第1 章　抗体制备技术 抗体 （antibody ，Ab ）是机体B 淋巴细胞受到抗原刺激后所产生的特异性球蛋白，故亦称为 免疫球蛋白。机体初次接触抗原后，激发机体产生的特异性抗体亲和力低、持续时间短；而当同 一抗原再次刺激机体后，则能产生高亲和力、高效价、持续时间长的抗体。由于抗体能与相应的 抗原发生特异性结合反应，因此特异性抗体是免疫学实验中常用的试剂，不仅对于抗原的分析鉴 定和定量检测极为重要，而且广泛应用于临床疾病的诊断、治疗和预防中。在免疫学检测中应用 的主要抗体是多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体常用免疫动物的方法获得，而单克隆抗体则 采用杂交瘤技术制备。本章主要介绍这两种抗体的制备方法。 实验一　多克隆抗体的制备 多克隆抗体 （polyclonal antibody ）是机体针对抗原的不同表位所产生的抗体混合物。是用制 备的纯化免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，在含有多种抗原表位的抗原刺激下， 该动物体内多个B 细胞克隆被激活并产生针对这种抗原多种不同表位的抗体混合物。含有这些特 异性抗体的动物血清称为免疫血清或抗血清，而从免疫血清中纯化的免疫球蛋白则称为抗体。 一、抗体制备的流程 优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，动物的应答能力以及免疫程序 （如免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素）。 因此制备高质量的抗体必须具备理想的免疫原、适宜的动物和切实可行的免疫方案。 （一）免疫动物的选择 免疫用的动物主要为哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、豚鼠及小鼠等。选择动物要依据 抗体制备的条件而定。 1．抗原与动物的种系　抗原的来源与免疫动物之间种系关系越远，其抗原免疫原性越强， 越易产生免疫应答；反之，种系关系越近，则抗原免疫原性越弱。如用鸡球蛋白免疫亲缘关系较 近的鸭或鹅，则免疫原性较差。 2 ．动物的个体状况　动物的年龄与健康状况可影响产生抗体的效价，年龄太小者易产生免 疫耐受，而年老体衰者免疫应答能力低下，不易产生高效价的抗体。所以用于制备抗血清的动物 必须是适龄、健壮、体重合乎一定要求的健康动物。免疫过程中应特别注意营养和卫生管理。 3 ．抗体的用量和要求　动物的选择常根据抗体的用途和量来决定。制备量大的抗体常选择 羊、马等大动物；如所需抗体的量少，宜用小动物，如家兔、豚鼠等。对蛋白质抗原大部分动物 均适合，常用家兔和山羊。制备供补体试验用的抗体可选择豚鼠。 （二）免疫方案 不同的抗原，其免疫原性的强弱不一，这取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、 2　 医学免疫学实验 物理形状和弥散速度等。在免疫动物时应考虑免疫原的剂量、免疫途径、次数和免疫间隔时间等 因素对免疫效果的影响。 1．免疫原的剂量　抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、注射途径、免疫次数以及受体动 物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等而不同。免疫原剂量过大或过小都易引起免疫耐受。 在中间剂量范围内，免疫原剂量适当加大，时间间隔延长，可产生较高效价的抗体。一般而言， 小鼠首次免疫剂量为每次50～400μg ，大鼠为每次 100μg～1mg ，兔为每次200μg～1mg。加强免 疫剂量为首次剂量的1/5～2/5。如要制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法； 如欲获得高效价的抗血清，则宜采用大剂量抗原长程免疫法。 2 ．免疫途径、次数和间隔时间　常根据抗原性质、免疫原性及动物的免疫反应性决定免疫 途径、免疫次数和间隔时间等。抗原注射途径可根据不同抗原及实验要求，选用皮内、皮下、肌 肉、腹腔、静脉或淋巴结等不同途径进行免疫。一般多采用动物的背部、足掌、淋巴结周围、耳 后等处皮内或皮下多点注射。两次免疫注射的间隔时间应长短适宜，太短起不到再次反应的效 果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般第一次和第二次间隔10～20d ，3 次及以后间隔 7～10d ，加佐剂者应为2 周左右。免疫的总次数一般为5～8 次。 3 ．佐剂的应用　佐剂可增强抗原的免疫原性，使无或弱免疫原性的物质变成有效免疫原。 如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔，在加用佐剂时一次注入剂量一般为0.5mg/kg ，如不加佐剂，则 抗原剂量应加大10～20 倍。动物实验中最常使用的佐剂为弗氏不完全佐剂 （Freund incomplete adjuvant ，FIA ）和弗氏完全佐剂 （Freund complete adjuvant ，FCA ），前者