等电聚焦电泳.ppt.ppt

等电聚焦电泳 背景介绍 　　 等电聚焦电泳技术（isoelectric focusing，IEF）是1980年慕尼黑工业大学食品科学和化学分析研究所的Radola B J发展起来，并经国外一些种子检验实验室改进的一种非常实用的电泳技术，广泛应用于生物学的各个领域。 该方法是利用蛋白质具有两性解离及等电点的特征，加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。主要特点是：灵敏度及分辨率高、重复性好，特别适用于大批量纯度检测和真实性鉴定以及遗传多样性等群体生物学领域的研究。 * 基本原理 等电聚焦电泳(IEF)是利用两性电解质载体形成一个连续而稳定的线性pH梯度，将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置 ，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。 * 如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度，则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的oH值的差别带上正电或负电。 * * 载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient)等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等电点而形成pH梯度。 IEF的分类 * pH梯度的形成 等电聚焦也是在电场下进行的一种精密分离技术，但由于必须在电场的方向附加一个pH场，利用各溶质迁移到pH等于其等电点的位置时便停止在那里而被分离。故技术的关键是如何形成稳定的pH场以及减小对流、扩散、散热以及电渗的影响。对于制备型的分离设备，解决以上诸问题的难度更大。 多种建立pH梯度的方法： 在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且不易稳定。 * 加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖，可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。 利用固定化两性载体形成pH梯度。就是把具有缓冲能力的基团或化合物用共聚或接枝的方法固定在载体上形成两性载体。载体可以是聚丙烯酞胺凝胶或葡聚糖等。被固定的化合物可以是带羧基的酸或带叔胺基的碱。采用这种方法可以形成稳定的pH梯度。但成本太高。 * 固定化两性载体和两性缓冲液相结合。 利用离子交换剂建立pH梯度。Sluyterma(1978)利用离子交换剂建立一个有pH梯度的柱进行等电聚焦，称为色谱聚集。 由外循环建立的pH梯度，Rilbe(1978)在两电极室把溶液进行循环，以在电泳分离室中建立一个稳定的pH梯度，称为流动电解。 缓冲液更新的方法。在电泳过程中，溶液的离子会产生电迁移。在两个电极室中离子的消耗或积累，可由外部加和或取出加以平衡，以维持电泳池中缓冲液的组成和pH等流量泵不变。 流动电解 * 两性介质载体的选择 易溶于水，理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导，前者保证pH梯度的稳定，后者允许一定的电流通过。 不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而