分子生物学第四章节.ppt

第四章 分子生物学的研究方法;一、重组DNA技术;工具酶 基因 载体 受体细胞;;;工具酶;活性定义 限制酶的一个活性单位（1U），原则上是在50μl的反应液中，37℃的温度条件下，经过1小时反应，将1μgDNA完全分解所需要的酶量。;主要连接酶的功能特点; 载体和插入片段具有相同的粘性末端 容易连接成环状的重组DNA分子 可能出现问题： 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； 插入片段可双向插入； 插入片段可多拷贝插入。 当DNA片段两端为非同源的粘性末端 可实现定向克隆，连接效率高，简捷;利用磷酸酶防止载体DNA的重新环化;。 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????;基因工程常用工具酶; E.coli. DNA聚合酶I E.coli. DNA聚合酶I大片段 （Klenow fragment） T4噬菌体DNA聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶 耐高温DNA聚合酶： Taq DNA聚合酶;载体(vector)是能够携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建而成的。;能在宿主细胞中独立复制; 具有多种限制酶的单一切点（多克隆位点）以便外源DNA插入； 具有筛选标记,以区别阳性与阴性重组分子; 分子较小，便于体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离； 表达载体:具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。;分类 ;克隆载体的特性 复制起始：在受体细胞中独立复制 多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 多选择标记：抗药性，其他遗传标记 分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大 ;分类;克隆载体pUC19质粒图谱