分子生物研究分析法(上).ppt

第五章 分子生物学研究法（上）; 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。;基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。; 5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术;5.1.1 三大奠基成就 ：;40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；; 1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验;Conservative Model;50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。; DNA提取技术： 如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。 ;DNA的体外切割和连接;; 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。 DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。 这就是基因克隆，或分子克隆 。 ;分子克隆的载体具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。;大肠杆菌成为分子克隆中最常用的转化受体。;1973 - Boyer, Cohen Chang;非洲爪蟾;重组DNA实验中常见的主要工具酶;;5.1.3 重组DNA技术历史上的主要事件 ;1965?;1982;5.1.4 基因克隆技术及其相关概念;限制性核酸内切酶;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；斜体 第四个字母代表菌株； 罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。;Bam HⅠ;DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。 T4ˉDNA连接酶 E.coli -DNA连接酶 T7ˉDNA连接酶;目的基因的来源;重组实验中的主要载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端 ;λ噬菌体载体的特点： 1、克隆的DNA有大小限制。 2、和外源DNA连接后，都要经过体外包装过程，把重组的DNA包进头部，和尾部装配成有感染性的噬菌体。 3、如果没有外源DNA插入，载体本身的DNA太小是不能被包装的，这样可确保转化后产生的空斑是重组体。 4、重组的λDNA由于利用噬菌体把它注入细胞中，因此和重组质粒DNA 转化相比，具有高得多的转化率。;Cos质粒载体：又叫粘粒载体（cosmid），是带有 cos 位点的质粒，是由λ噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。 柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自λ噬菌体粘性末端的 DNA 片段，即 cos 位点，其对于将 DNA 包装成λ噬菌体粒子是必需的。;结构图;柯斯质粒载体的优点： ① 具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在； ② 具有质粒 DNA 的复制方式，重组 DNA 注入宿主细胞后，两个 cos 位点连接形成环状 DNA 分子，如同质粒一样进行复制； ③ 具有克隆大片段外源 DNA 的能力，柯斯质粒本身一般只有 5~7kb 左右，而它可克隆外源 DNA 片段的极度限值竟高达 45kb ，远远超过质粒载体及λ噬菌体载体的克隆能力。这是其最大优点。;单个克隆载体所容纳的外原DNA片段