鸡的标记选择筛选和基因分型性能案例研究.pdfVIP

ApplicationNote 在基因分型的de novo SNP选择过程中 如何减少测序错误、单态和表现差的标记物 鸡的标记选择、筛选和基因分型性能案例研究 摘要 近年来全基因组DNA测序的发展彻底改变了我们发现基因组变异的能力，从而实现了高统计意义的基因分型研究。本应用指南介绍 了筛选大SNP集合的过程，以便灵巧地选择出最具信息量的变异，用于下游的高通量基因分型实验，这些SNP是在测序研究中鉴定出 的。此过程已被成功应用在畜牧、水产动物和植物的基因分型标记组合的开发，包括二倍体和多倍体物种。在此，我们介绍了一个案 例研究，应用于鸡的标记物验证和选择。 简介 大型的SNP发现项目证实，大量样本的低覆盖度NGS是一种比少量样本的深度NGS更有统计学意义的de novo变异发现模式1。然而， 虽然有着强大的发现能力，NGS技术也被认为带来高比例的序列错误和丢失数据2 ，这在低覆盖度测序时被放大。 据报道，不同供应商的NGS平台有着6.3%至7.8%的错误发现率3 ，这相当于在50,000个SNP的分析组合中有超过3,000个假阳性。在 真阳性SNP位点，基因型准确率随着覆盖度的下降而下降。我们利用Axiom®基因分型方案对来自低和高覆盖度的NGS数据的数百万 个SNP基因型开展了广泛验证，Axiom®方案本身与金标准参考数据集有着99.8%的一致性。 我们的验证分析(表1)表明，30倍NGS数据对所有基因型种类有着高于98%的一致性。其他人此后表示，以可接受的低错误率检出基因 组中的基因型，需要40倍的NGS覆盖度4 。我们的分析还表明，4倍NGS SNP发现数据通过错误检出杂合子而高估了主要纯合子频率。 这种偏向导致，主要纯合子一致性与芯片参考数据相比看似不错，但代价是9.9%的杂合子错误率和11.6%的次要纯合子错误率。 因此，低覆盖度NGS数据中的序列和基因型错误会成为错误和冗余SNP的主要来源。当然，由于与选择的基因分型分析不兼容、附近 的二次多态性或其他技术因素，更多的标记物会聚类不佳。 Concordance compared to Axiom® genotypes 4x data 30x data 主要纯合子 99.7% 99.9% 杂合子 90.1% 99.8% 次要纯合子 88.4% 98.5% 表1 ：与Axiom®基因分型芯片上产生的参考基因型数据集相比，低和高覆盖度新一代测序 数据的基因型一致性。 假阳性和冗余标记对研究统计学意义和成本的影响 对于一个在芯片或其他技术上开发基因分型标记组合的实验室来说，这些标记丢失来源的影响很明显。首先，包含因测序错误引起的 假阳性SNP或表现不佳的标记物浪费时间和金钱，并削弱标记物组合分析的能力以及使用它的研究。其次，在真正的SNP位点，NGS 基因型的错误会导致不正确的等位基因频率估计、不正确的连锁不平衡(LD)图谱构建，最终导致标记物选择不理想。 5 最近发表的一篇文章介绍了大豆基因分型芯片的设计和验证，表明如果de novo标记在选择之前未经过验证，标记组合的性能可能与 原先的芯片设计有相当大的差异。从60,800个SNP的目标组合开始，作者报道了4,704个(8%)标记因假阳性、群体研究中的单态性或聚 类性能差而丢失。当他们还包含因微球阵列制造过程中引起的随机丢失时，便总共失去了13,465个(22%)芯片内容。 计划de novo标记验证策略的研究人员可能会降低测序错误、不准确的等位基因和LD预测、标记选择不佳，因假阳性、群体特异的单 态、下游基因分型实验中标记表现不佳而引起的丢失。通过验证策略，研究人员可提高覆盖度，增强统计学意义，并减少标记冗余。 可靠标记物选择策略的要求 可靠的标记组合开发需要在选择之前进行de novo变异的验证。这将带来一组经过优化的标记，它们具有研究透彻的覆盖度、性能和群 体相关性。 使用另一种技术进行数据验证的概念在科学中并不少见。例如，文献中有数百篇文章用实时定量PCR来验证芯片所发现的基因表达差