药敏试验作业指导书.docxVIP

药敏试验作业指导书1.目的保证药敏试验结果的可靠性，指导临床医生对各类患者选择最佳抗生素制剂在一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物流行病学资料。2.原理抗生素敏感试验是测定抗生素或其他生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这种能力可以通过稀释或扩散法来测定。3.方法 纸片扩散法，E-试验法3.1纸片扩散法（K—B法）（需氧和兼性厌氧菌体外药敏试验）3.1.1 实验条件 ① M-H平板，适合肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌；② 羊血M-H平板，适合淋病奈瑟菌、链球菌;③ HTM平板：适合于嗜血杆菌属的药敏试验3.1.2 原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种检测菌的培养基上，纸片中含有的药物吸收琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的检测菌的生长受抑制，从而形成透明的抑菌圈。根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床已知敏感或耐药菌株的状态来 是否对抗菌药物敏感的实验方法3.1.3材料及准备3.1.3.1 M-H琼脂培养基的制备(见培养基制备操作程序），使用前若培养基湿度过大，可置于35℃温箱孵育10-30min。3.1.3.2 纸片的选择 见敏感试验选药表附表1纸片的贮存 置于-20℃冰箱冷冻，使用前30min移出冰箱，平衡至室温方可使用。3.1.3.3 菌液的配制 从孵育了24H的琼脂平板上挑取3-5个单个菌落用灭菌0.9%的生理盐水制成悬液。调整至0.5麦氏单位。3.1.4方法3.1.4.1 菌悬液最好在15min内接种，用无菌棉签蘸取菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，挤出多余的接种菌液，在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转60度，最后用棉签涂抹琼脂。3.1.4.2 待平板上的水分被琼脂完全吸收后（约15分钟），用无菌镊子取纸片贴在琼脂平板表面或分配器贴纸片，并用镊尖轻压一下保证充分接触琼脂并将均匀分布，每张纸片间距不能少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。3.1.4.3 贴完纸片后，15min内翻转平板，置于35℃温箱孵育。3.1.5 质控 K-B法质控菌株常规用：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。3.1.6 结果及解释3.1.6.1 检查平板：若涂布满意，接种物准确无误，抑菌圈应为正圆形，菌落应相互融合生长。若见出现明显的单个菌落生长，是菌落浓缩过稀的缘故，应重做实验。3.1.6.2 测量直径 直尺测量完全抑制区域（肉眼判读），读取纸片直径，精确到毫米。3.1.6.3 抑菌圈大小的解释请参照CLSI的报告方式，结果应报告细菌对被测药物敏感，中介或耐药。3.1.7结果报告 药敏结果应选择报告3.1.7.1 对于某些细菌，部分抗生素结果不能报告或报告耐药。如一代，二代头孢菌素和氨基糖苷类对沙门菌属和志贺菌属；除苯唑外所有β-内酰胺类抗生素对MRSA；头孢菌素、低水平氨基糖苷类，克林霉素、SXT对肠球菌；头孢菌素对李斯特菌；青霉素、广谱头孢菌素和氨曲南对ESBL阳性菌株。3.1.7.2 肠球菌对万古霉素中介或耐药时需要做Etest实验确证。3.1.7.3 应用万古霉素Etest检测其对葡萄球菌的敏感性。3.1.8 注意事项3.1.8.1 有些药物几乎会立即扩散，纸片一经接触，不可再移动。3.1.8.2 某些产粘液型的细菌，不易配制菌液，可直接挑取菌落划线于M-H琼脂平板。3.2 Etest实验法3.2.1 原理 浓度梯度法琼脂扩散试验，即用纸片扩散试验的方法，得到MIC的结果。3.2.2方法步骤 3.2.2.1 培养基配制 同K-B 法3.2.2.2 菌液制备和接种 同K-B 法3.2.2.3 E试验条的刻度面朝上，不得贴反，一经接触琼脂，不得再移动。3.2.2.4 孵育 接种好的平板，放置室温让接种液充分被吸干后，置于35℃温箱18-24h读取结果。3.2.3 结果及解释孵育后围绕试纸条形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试纸条的横切相交处试纸条上的刻度即是测定抗菌药物对测试均的最低抑菌浓度（MIC）。单位为微克每毫升，根据MIC的值参照CLSI规定，报告相应的敏感和耐药。3.2.4 注意事项3.2.4.1 大多数，试纸条两侧的抑菌圈与试纸条相交一致，读取相交处的数值。3.2.4.2 试纸条两侧的抑菌圈与试纸条相交不一致，读取较高数值。4.药敏试验质控监测药敏试验步骤的精密度和准确度；监测所用试剂的质量，监测进行试验和判读结果的工作人员的操作纸片必须保存于-20℃的冰柜中。　5.特殊耐药细菌需复核后发报告5.1 对万古霉素中介或耐药的肠球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。5.2 亚胺培南中介或耐药的肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌。5.3 青霉素耐