增加RT-PCR灵敏度分离高质量RNA成功的cDNA合成-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.12.4.3 增加RT-PCR 灵敏度 分离高质量RNA 成功的cDNA 合成来自高质量的RNA 。高质量的RNA 至少应保证全长并且不含逆转 录酶的抑制剂，如EDTA 或SDS。RNA 的质量决定了你能够转录到cDNA 上的序列信 息量的最大值。一般的RNA 纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol 试 剂法将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解 RNA 。Trizol 试剂法可以从最少 100 个细胞或1mg 组织中提取RNA 。 一般不必使用 oligo(dT)选择性分离 poly(A)+RNA 。不管起始模板是总 RNA 还是 poly(A)+ RNA ，都可以检测到扩增结果（图2 ）。另外，分离poly(A)+ RNA 会导致样品 间 mRNA 丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有 mRNA 时，poly(A)+ RNA 会增加检测的灵敏度。 为了防止痕量RNase 的污染，从富含RNase 的样品（如胰脏）中分离到的RNA 需要贮 存在甲醛中以保存高质量的RNA ，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA ， 在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA ，在水中保存3 年仍 保持稳定。另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase 的降解比小转录本更敏感。 为了增加贮存RNA 样品的稳定性，可以将RNA 溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。 用于保存RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA 的杂物。来源于胰脏的RNA 至少可以 在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA 时，可以使用下列方法沉淀RNA ：加入NaCl 至0.2M 及4 倍体积的乙醇，室温放置3-5 分钟，10,000×g 离心5 分钟。 在逆转录反应中经常加入RNase 抑制剂以增加cDNA 合成的长度和产量。RNase 抑制 剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT ）存在的条件下加入，因为cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA 的RNase 。蛋白RNase 抑制剂仅防止RNase A ，B ，C 对RNA 的降解，并不能防止皮肤上的RNase ，因此尽管 使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase 。 中国试剂网 3.12.4.3 使用无RNaseH 活性（RNaseH- ）的逆转录酶 逆转录酶催化RNA 转化成cDNA 。不管是M-MLV 还是AMV ，在本身的聚合酶活性之 外，都具有内源RNaseH 活性。RNaseH 活性同聚合酶活性相互竞争RNA 模板与DNA 引物或 cDNA 延伸链间形成的杂合链，并降解 RNA ：DNA 复合物中的 RNA 链。被 RNaseH 活性所降解的RNA 模板不能再作为合成cDNA 的有效底物，降低了cDNA 合 成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH 活性将会大有裨益。 SuperScript Ⅱ逆转录酶，RNaseH- 的 MMLV 逆转录酶及 ThermoScript 逆转录酶， RNaseH- 的 AMV ，比MMLV 和AMV 得到更多量和更多全长的cDNA 。RT-PCR 灵敏 度会受cDNA 合成量的影响。ThermoScript 比AMV 的灵敏性强得多。RT-PCR 产物的 大小受限于逆转录酶合成cDNA 的能力，尤其是克隆较大的cDNA 时。同MMLV 相比， SuperScrip Ⅱ显著提高了长RT-PCR 产物的产量。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳 定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。 在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10μCi 的[α- P]dCTP 。第一链的总产量 使用TCA 沉淀法计算。全长cDNA 使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除 并计数的方法分析。 RNaseH 产生的障碍 RNaseH 对第一链cDNA 的影响。RNaseH 在cDNA 合成期间降解RNA:DNA 复合 体中的RNA 。红色箭头代表潜