对样本进行断层扫描以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.ppt

涡虫纲扁虫肌动蛋白丝 鬼笔环肽 高清晰成像 培养的人肝癌细胞吖叮橙染色 高清晰成像 2、半定量荧光强度分析 荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。 随机圈取细胞 可得到所圈细胞的相对荧光强度值 利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。 3、荧光标记表达量测定 4、分层扫描（切片扫描） 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。 较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 4、分层扫描（切片扫描） 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。 4、分层扫描（切片扫描） 5、多色荧光标记检测 普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。 绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子 肺动脉内皮细胞 蓝色：Hoechst 33342 ，染DNA 红色：PI，染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白 常用荧光探针介绍 细胞活性探针 细胞器探针 细胞骨架探针 核酸探针 细胞内离子探针 细胞活性探针 活细胞探针：吖叮橙（AO） 是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中浓集。 死细胞探针：碘化丙锭（PI） 膜不透性DNA探针，细胞膜破损后与DNA结合 核酸探针 Hoechst 与DNA结合，分辨率高 Hoechst 33258? Hoechst 33342? 毒性低 先进行免疫染色再进行Hoechst染色 DAPI 与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链DNA结合无荧光增强。荧光强度比Hoechst低，光稳定性强于Hoechst。 细胞器探针 线粒体探针：罗丹明123（Rhodamine123），能渗入细胞，带阳离子的荧光探针，不染色内质网。 溶酶体探针：中性红（Neutral Red） 内质网探针：DiOC6属于短链碳酸花青苷染料。可标记活细胞内质网，也可用于甲醛固定的细胞内质网。 细胞骨架探针 F-肌动蛋白荧光探针： 鬼笔环肽：特异性地与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳摩尔浓度下也可标记 1 ??荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W）或者高功率LED光源，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。滤片系统是荧光显微镜的重要组成部分，由激发滤片、二向色性滤光片、发射滤片组成。激发滤片位于光源和标本之间，允许特定波长范围的光通过，作为样品的激发光。发射滤片位于物镜和目镜之间，允许标本发射的荧光通过，以获得清晰的图像。二向色性滤光片在激发滤片和发射滤片之间，是一种入射角为45o的干涉滤光片，它可以反射一定波长的光同时透过另外波长范围的光线 1 1 1 激光共聚焦显微镜原理：它是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具.精确地对光谱的本质进行分析，区分发射光谱高度重叠的不同标记的信号。最重要的是，对于多色的荧光染色，它能彻底消除了荧光串色的影响，同时最大限度的减少了样品荧光信号的损失。这些都是一般光镜所不能达到的。 1 激光共聚焦显微镜原理：