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猪无名高热症病原体的检测 54中国兽医杂志2009年(第45卷)第8期ChineseJournalofVeterinaryMedicine 猪无名高热症病原体的检测 卫秀余,沈强,余红梅,刘婧怡 (上海市奉贤区动物疫病预防控制中心,上海奉贤201400) 中图分类号:$858.28文献标识码:B文章编号:0529—6005(2009)08—0054—02 许多报道或研究报告都显示,在发生无名高热 症的猪群中可以检测到的病原体有1O多种,其中 既有病毒又有细菌.但这些报道或研究报告都不是 在同一猪群中同时检测到这些病原体,因此对确定 究竟有哪些病原体在猪无名高热症中起了重要作 用带来了困难.为此我们于2006年1O月～2007 年1O月对来自本区和邻近省市发生无名高热症 的15个规模化猪场送检的样品用PCR,ELISA,细 菌分离等方法进行了系统的检测,以查明引起猪无 名高热症的真正致病病原,报告如下. 1材料 1.1猪群发生无名高热症猪场的l}缶床判断[1]:发 病率50以上.病猪表现皮肤发红,厌食,体温 40.5℃～4l_5℃.采集6头病死猪的肺淋巴,肺, 脾,肾等内脏器官,用于病毒和细菌检测.采集6份 饲料样品进行真菌毒素的检测. 1.2PCR,RT—PCR检测所用的试剂均购自华美生 物工程公司.ELISA检测抗原试剂盒均购自美国 IDEXX公司,酶标检测真菌毒素试剂盒均购自德国 Beacon公司. 2病原体检测 2.1RT—PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的方法 2.1.1引物的设计参照GenBank公布的 PRRSVVR2332株ORF7基因序列,设计了1对引 物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成. 上游引物:5一ACGAGCTCTTAAACGAGG AGTGG一3,下游引物:5r_TCGCCCTAATTG AATAGGTG一3. 2.1.2RNA的提取取病猪肺,肺淋巴剪碎,按 1:3～1:5加PBS缓冲液研磨至不见组织块,转入 离心管中,反复冻融3次,10000r/min离心1O min.取上清液100L+400L变性液+100L 氯仿异戊醇液(24:1),振荡2～3min.14000r/ rain离心5min.小心吸取上清液100L加入新的 离心管中,再加人100L异丙醇,14000r/min离 心10min.小心倾去液体,然后加入200L75 乙醇.颠倒混合数次后,14000r/min离心5min. 收稿日期:2008—08—18 弃去上清,干燥沉淀物,加入30肚LDEPC水溶解沉 淀,一20℃保存备用. 2.1.3RT—PCR扩增体系RT—PCR酶混合物2 gL,2O*Buffer2L,25mmol/LMgC122L,10 mmol/LdNTP2L,上游引物1L,下游引物1 L,RNA模板3L,无菌双蒸水12L. 2.1.4反应条件和循环次数37℃反转录6O min,94℃变性5min,然后94℃1min,54℃1min, 72℃1.5min,30个循环后72℃延伸10rain. 2.1.5检测质量的控制每次检测均设立阴性,阳 性对照,电泳时设立DNAMarker,根据所设计的引 物,PRRSV阳性产物为514bp. 2.2PCR检测猪伪狂犬病病毒(PRV)的方法 2.2.1引物的设计参照GenBank公布的 PRVgE基因序列设计1对引物,由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成.上游引物:5r_GCC ACCATCGCAGAGGAACAA一3,下游引物:5 CGGGTGGCAGGCGGTCTCGAA一3. 2.2.2DNA的提取取病猪肺,肺淋巴剪碎,加适 量PBS,匀浆后反复冻融3次.把匀浆好的组织液 加入l_5mL的离心管中,10000r/rain离心l0 min.取上清,加入等体积的氯仿,混匀,10000r/ rain离心10min,反复抽提3次.取上清,加入终浓 度为1SDS,50mg/mL的蛋白酶K,55℃水浴1 h至澄清.然后加入等体积的酚混匀,10000r/min 离心10min,取上清,再用1:1的酚氯仿,氯仿各 抽提1次.取上清,加人1/10体积3mol/L醋酸钠 (pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,一2O℃过夜, 融化后12000r/min离心15min,直至管底有沉 淀.弃去上清,干燥沉淀物,加入30L无菌双蒸 水,溶解沉淀,一20℃保存备用. 2.2.3PCR扩增体系20*Buffer2L,25 mmol/LMgC122L,10mmol/LdNTP2L,上游 引物1L,下游引物1L,DNA模板3L,Taq酶 0.2L,无菌双蒸水13.8L. 2.2.4反应条件和循环次数95℃变性10min 后,94℃1min,60℃1min,72℃1.5min,共35个 循环