生物化学实验层析实验.pptVIP

* 实验项目：氨基酸（单向）纸层析 层析技术的基本知识 材料与方法 结果与分析 实验报告及课外作业 层析的概念：1903年俄国植物学家Tswett发现植物叶子中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成色谱，故称这种混合物分离的方法为色谱法（chromatography），又称色层分析法或层析法，随后被广泛用于无色物质的分离与层析。近半个多世纪以来，层析技术发展很快，由于这一技术具有分离效率高、应用范围广、分析速度快、样品用量少、易于自动化及能够与其他方法配合使用等优点，因此层析法近年来在各类分析化学方法中有十分重要的地位，已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科的重要研究手段。 实验目的：使学生掌握层析的概念、层析技术的原理、层析技术的发展状况以及层析技术的应用范围，同时使学生掌握纸层析技术的基本操作规程。 1 层析技术的基本知识 1.1 层析的概念 层析即色层分析也称色谱（chromatography），是分离物质、鉴定物质（定性或定量）常用的生物化学技术，它是由两个相组成的系统，一个为固定相或静相（stationary phase），一个为流动相或动相（mobile phase）。混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数（partion或distribution coefficient）来描述。 1.2 层析的基本原理 层析法各种各样，但基本原理是一致的。它是利用混合物中各组分理化性质（分子形状和大小、带电状态、溶解度、吸附能力、分配系数、分子极性以及分子的亲和力等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定的（称为固定相），另一相则流过此固定相（称为流动相），造成流动相对固定相作单相相对运动，流动相推动样品中各组分经固定相向前迁移，使各组分迁移速度不同，而对物质进行分离的方法。固定相可以是固体、液体或一种固体和一种液体的混合物，而流动相可以是一种液体或一种气体。 表1-1 层析的一般分类 固定相 流动相 装置 依据原理 名称 固相吸附剂 固相离子交换剂 固体 液体 液体 液体 固体 固相配基 固体 固体 液体 液体 液体 液体 液体 液体 液体 液体 气体 气体 柱 柱 薄层 柱 薄层 纸 柱 柱 柱 柱 吸附 酸碱度，极性 分配系数，吸附 分配系数 分配系数 分配系数 分子大小 分子亲和力 吸附 分配系数 吸附层析 离子交换层析 吸附薄层层析 分配层析 分配薄层层析 纸层析 凝胶层析 亲和层析 气体吸附层析 气体分配层析 层析方法有许多种，根据两相的状态和分离依据的原理的不同进行分类如下表。 1.3 常用的层析技术种类 1.3.1 柱层析 层析柱中的填充物或称支持物都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。支持剂吸附着一层不会流动的结合水，可以看作固定相，沿固定相流过的与它不互溶的溶剂（如苯酚、正丁醇等）是流动相。由填充料构成的柱床可以设想为由无数的连续板层构成，每一板层都起着微观的“分溶管”作用。当用洗脱剂洗脱时，即流动相移动时，加在柱上端的氨基酸混合物样品在两相之间将发生连续分配，混合物中具有不同分配系数的各种成分沿柱以不同的速度向下移动，分部收集柱下端的洗脱液。收集的组分分别用茚三酮显色定量。 图1-1 柱层析示意图 1.3.2 薄层层析 图1-2 薄层层析装置。薄层层析分辨率高，所需样品微量，层析速度快，可使用的支持剂种类多。如纤维素粉、硅胶和氧化铝粉等，因此应用比较广泛。薄层层析的大体步骤如下：把支持剂涂布在玻璃板上使成一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层（如图1-2），使样品中各个成分分离开来，最后进行鉴定和定量测定。 图1-2 薄层层析装置 1.3.3 高效液相层析 高效液相层析（high performance liquid chromatography，简称HPLC）曾称高压液相层析，是近二十多年内发展起来的一项快速、灵敏、高效的分离技术。 HPLC的特点是：① 使用的固定相支持剂颗粒很细，因而比表面积很大；② 溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。多种类型的柱层析都可用HPLC来替代。高效液相的图解见下图。 图1-3 高效液相层析的图解 1.3.4 离子交换层析 离子交换柱层析（ion-exchange column chromatography）是一种用离子交换树脂作支持剂的层析法。 离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）等不溶性高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质（