模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术演示试验.ppt

模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术演示实验 刘吉平、曹阳、Smith J.E、郝娟 英国国际发展部DFID项目和广东省科学技术厅国际合作配套项目（2001.3-2004.4） 家蚕微粒子病诊断沿革 1 桑蚕微孢子虫（Nosema bombycis，简称Nb）------ 家蚕微粒子病原 法国学者Louis Pasteur （1870）：母蛾镜检法 现在中国广东蚕种生产环节：母蛾集团检验法 70年代以来，各种的免疫学诊断法 90年代以来，应用PCR技术、核酸杂交方法 用于家蚕微粒子病的检验和诊断 2 近缘微孢子虫对家蚕的交叉感染 光镜、显微镜的形态学鉴别及分类 血清学方法、组织免疫学方法的鉴别及分类 分子生物学方法的应用 ----PCR分子标记鉴别和核酸分子杂交鉴别 3 存在问题 （1）家蚕微孢子病的诊断：目前仍然以母蛾集团检验法为有效的方法，分子诊断方法 的灵敏度、有效性、准确性、实用性和可操作性没有解决 （2） 家蚕微孢子虫病原的分子系统发育学研究结果与形态学分类鉴别结果的异同比较 存在 困难 4 关键原因分析 分子生物学诊断方法的标记基因和标记序列的特异性/代表性 PCR的原理 Polymerase Chain Reaction Amplification(PCR)技术可以根据任何一段DNA片段的两端已知序列设计引物（Prime），将目的DNA片段进行PCR扩增放大，达到电泳可检测、可回收的数量级。 可选用的家蚕微孢子虫PCR特异引物设计 1 caccaggttg attctgcctg acgtagacgc tatactctaa gattaaccca tgcatgttta V1f(1-22) / mP1F 61 ttgaatataa agaaaagacg aacagctcag taactcttat ttgatttgat gtattaggat 121 tctaactatg ttaaattata ggtaacaata atacaataag aataagatct atcagttagt 181 tgttaaggta atggcttaac aagactatga cggataacgg tattactttg taatattccg 299f(224-244) 241 gagaaggagc ctgagagatt gctactaagt ctaaggattg cagcaggggc gaaacttgac 301 ctatgatatt atattgaggc agttatgagt agtattttat aattattgta gtattgtaag 530f(395-410) 361 tacatattac aagataaatc ggagggcaaa tcgagtgcca gcagccgcgg taatacttgt 530r(395-410) 421 tccgatagtg tgtatgatga ttgatgcagt taaaaagtct gtagtttatt tataataagc 481 attgtaaggt atactgtatg gttaggagag agatgaaatg tgataaccct aactggatga