沉淀与膜分离.doc

高级生物化学（生物化学研究技术） 研究生的特点：“研究”系统性、专一性。 各学科研究的共性：机理的研究(物质基础—蛋白质)，通过机理的研究，使研究者由 一叶障目 不见泰山 一叶知秋(蛋白质种类与含量的变化)。 恩格斯曾说:生命是蛋白质的存在方式,这种存在方式本质上就在于蛋白质化学成分的不断自我更新. 这就是说:没有蛋白质的存在,也就没有生命。 本课程的主要内容：以蛋白质为主线（因为还有基因工程原理课讲核酸）。 沉淀技术、离心技术(常与沉淀技术结合使用)、层析（色谱）技术、电泳技术、免疫化学技术(与亲和层析有重叠)、酶分析技术、同位素示踪技术、蛋白质与核酸的序列分析技术。阐明蛋白质等生物大分子的分离、分析原理。 生物化学与分子生物学研究技术： 生物化学与分子生物学研究技术是研究生物大分子最基本、最重要的技术之一，是生命科学发展过程中必不可少的重要组成部分。生物化学与分子生物学研究技术都是以生物大分子为研究对象，是目前在生物大分子水平上研究的最常用技术。生物化学研究技术是以蛋白质研究技术为主，介绍一些相关生物化学技术如：光谱技术、色谱技术、蛋白质电泳技术、蛋白质测序技术、超离心技术等。分子生物学研究技术是以核酸化学为主介绍一些相关的研究技术：如基因构件、分子克隆、DNA测序、核酸电泳等技术。从基因工程或蛋白质工程的角度说分子生物学研究技术称之为基因工程上游技术，生物化学研究技术称之为基因工程下游技术。前者具有一定的共性，后者具有一定的个性特点。但是从广义上来说许多技术的分析原理都是相同的，只是在实际应用中各有侧重。 生物工程下游技术：泛指从工程菌或工程细胞的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量监测所需要的一系列操作技术。其中产品的分离纯化是最重要的部分。主要包括离心、沉淀、膜分离、色谱分离、电泳分离等。 目标产品蛋白质的分析检测（结合功能变化）：1. 蛋白质的含量与纯度；2. 氨基酸分析；3. 蛋白质的分子量测定； 4. 等电点；5. 肽谱分析（结合裂解方法）；6. 蛋白质的突变点分析(酶)； 7. 二硫键分析；8. 序列测定；9. 蛋白质翻译后修饰的分析。 随着蛋白质组计划的展开，下游技术显得越来越重要，以致多数用人单位要求熟悉“色谱技术等下游技术”本课程采用讨论式 欢迎大家提出问题、积极参与讨论！ 参考书目 1．赵永芳编著，生物化学技术原理及其应用，武汉大学出版社，1995年7月第二版 2． （美）C.W.迪芬巴赫等著，黄培堂等译，PCR技术实验指南，科学出版社，1998年8月第一版，1999年4月第二次印刷 3．（美）F.奥斯伯等著，颜子颖等译，精编分子生物学实验指南，科学出版社，1998年6月第一版 4．杨安钢、毛积芳、药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年2月第1版 5. 陈毓荃主编，生物化学实验方法和技术，科学出版社，2008年6月第一版 前序： 要从生物体内获得某一组分进行分析与研究，首先要确定取样对象及其部位！ 一、取样的原则 取样量：能代表研究对象的本质，从自然群体或待研究的群体中取样；样本量小于30份为小样本，大于30则为大样本；研究病例时，可能只有一个样本，难于总结出规律(只能对症医治) 部位：表现研究特征与本质的部位，越精细越好，如：表现特征的部位，缺锌的叶主脉两侧、缺钙的根尖、茎尖等停长坏死。研究癌细胞就要从癌组织中取样。细胞分化常常从某一个细胞或几个细胞开始，所以取样要精细，才能有针对性。 二、提取与分离或制备样品分子 1. 生化分离分为分离分析与分离制备，分离分析即分离各组分，而进行定量与定性鉴定，不一定把某组分从混合物中分离提取出来，如，氨基酸的定性与定量分析。 分离制备则是为获得某一单纯组分。并有活性或生理功能，这与其结构有关，所以，生化分离与化学分离不同，要保证其结构和性质不改变。有如下特点： 成分复杂且时刻在发生代谢变化。要注意时间！ 有的含量很低，用材料多。如，激素、酶等。 离开活体易变性，所以条件要温和，如有的要低温使代谢减慢不变质。 ⑷ 都在溶液中进行，影响因素多，要重复性好，就必须严格规定材料、方法、条件与试剂等。 (5) 纯度鉴定常需多种方法：层析、电泳、染料显色、理化特性分析等。 故生化分离与制备大都根据混合物中不同组分分配率的差别（顺其自然，先试验再总结规律，用于实践），将它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中（如有机溶剂抽提油脂、盐析、结晶等沉淀分离蛋白），或将混合物置于某一物相中（多是液相），外加一定的作用力，使各组分分配于不同区域而分离（如电泳、超离心、超滤等）。先介绍溶剂提取、沉淀、膜分离、浓缩与干燥。现代生化分离制备常用沉淀、离心、层析、电泳四大生化基本技术。 第一节 溶剂提取法 利用溶剂的溶解作用，从细胞中