核酸探针的标记和检测分子杂交是核酸链间碱基配对规则.pdfVIP

中国试剂网 3.13.14.7 分子杂交技术（二） 四、核酸探针的标记和检测 分子杂交是核酸链间碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特 性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条 用某种可以检测的分子进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制 备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是放 射性同位素标记。常用的放射性同位素有 32P 和 35S 前者能量高，信号强，最 常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制 （32P 半衰期为 14.3 天，35S 半衰期为 87.1 天，125I 的半衰期为 60 天），3H 的 半衰期长达 12.3 年，但它所释放β放射线能量太低（0.018Mev ），只能用于组织 原位杂交。由于同位素标记的探针在使用过程中存在着上述缺点，近些年来，人 们在寻找非航船性标记物方面取得了很大进展，国际上已有多家公司相继推出多 种非放射性探针标记试剂盒，在国内也已具备生物素类标记物的生产能力，并有 相应试剂出售。目前，非放射性标记物有下述几类：金属如 Hg ，荧光物质如 FITC ； 半抗原如地高辛；生物素；酶类如辣根过氧化物酶（HRP ）。半乳糖苷酶或碱性 磷酸酶（AKP ）等。不同的标记物，所标记探针的方法及检测方法也各异。下面 仅就国际上较常用的，有实用价值或发展前景的几种核酸标记方法及其显示方法 分两方面简述如下。 （一）核酸探针的常用酶促标记技术 1．缺口平移 该技术由 Kelly 等于 1970 年创立。其原理是首先用 DNA 酶 在双链 DNA 探针分子的一条链上制造一些缺口（nick ）,缺口处会形成 3 ’—羟 基末端，这时再在大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的催化下将核苷酸残基加在 3 ’－羟 基上，同时，根据大肠杆菌酶 DNA 聚合酶 I 的 5 ’→3 ’核酸外切酶活性，此酶 将缺口 5 ’侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移（nick tr －anslation ）。根据 这个原理，如果用高强度的放射性核苷酸（通常为α-32PdATP ）置换先前存在 的核苷酸，则可制备比活性高达 108cpm （每分钟计数）/ μg 的 32P 标记 DNA 。 中国试剂网 3.13.14.7 用缺口平移法标记的 DNA 探针能满足大多数杂交要求。 2 ．DNA 快速末端标记 大肠杆菌 DNA 聚合酶 i 经枯草杆菌蛋白酶切割可 得到两条多肽链，其中分子量为 76kd 的大片段称为 Klenow 片段。该酶具有完 整聚合酶 I 的 5 ’→3 ’聚合酶活性和3 ’→5 ’核酸外切酶活性，但缺乏5 ’→3 ’ 核酸外切酶活性。利用 Klenow 片段可以填补由限制酶消解 DNA 所产生的 3 ’凹 陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA 的凹陷 3 ’末端。用Klenow 片段 标记末端一般只用一种[ α-32P]dNTP，加入反应的[ α-32P]dNTP 取决于 DNA 末 端延伸的 5 ’末端序列，例如，用Ecor I 切割 DNA 所产生的末端用[ α-32P]dNTP 标记。标记反应可在一种限制酶消解 DNA 后立即进行，不需去除限制酶或使其 失活，也不需更换缓冲液，具有 3 ’延伸的DNA 末端不能被 Klenow 片段有效在 标记，欲标记这类分子可用 T4DNA 聚合酶。 选用这种标记方法是为了产生可用于凝胶电泳时作大小参照物的 DNA 片 段。因为标记的 DNA 片段与其摩尔浓度成比例，而不与片段大小成比例，在限 制酶消化物中，小的和大的片段都以相同程度被标记。因此，可使用放射自显影 术确定不有被溴化乙锭染色所观察到的大小 DNA 带，尤其适用于 Southern 吸印 杂交时分子量标志物的标记。通过选择相应标记的 dNTP ，该法还可以只标记 DNA 分子的一端。例如，若 DNA 片段的两个末端分别是 Bam H I 和 Hind III