PBL表型测定.docVIP

① TLR9 expressin of MSC induced by Thymosin alpha 1（0.1ug/ml） TLR9 268bp 1 2 3 4 5 6 7 Marker β-actin 421bp 1 2 3 4 5 6 7 Marker (1-5为Thymosin alpha 1不同诱导时间，依次为0、1、 2、3、6h，6为空白对照，7为HL-60细胞阳性对照) ② INDO expressin of MSC induced by Thymosin alpha 1(18hr) INDO 430bp 1 2 3 4 5 6 Marker (1-3为β-actin，4-5为不同Thymosin alpha 1浓度， 依次为1ug/ml、2ug/mlγ-干扰素诱导MSC作阳性对照) ① TLR9 expressin of MSC induced by Thymosin alpha 1 1 2 3 4 5 6 7 Marker (1-5为Thymosin alpha 1不同诱导时间，依次为0、1、2、3、6h， 6为空白对照，7为HL-60细胞阳性对照) 一、BM-MSCHOU—Activation of PHA-stimulated PBL 表型： 按MSC：PBL1：20的比例，将0.3ml 1×10/ml的 MSC接种于24孔板内，加入0.2ml培养液，孵育过夜后，加入0.3 ml 2×106/ml PBL和0.2ml培养液，0.5 ml 80μg /ml PHA和0.5 ml培养液，37℃，5%CO2培养72hr后收集细胞，用PBS离心洗涤2次，FCM备用；设组及布板如下：—Activation of PHA-stimulated PBL 表型： 按MSC：PBL1：20的比例，将0.3ml 1×10/ml的 MSC接种于24孔板内，加入0.2ml培养液，37℃，5%CO237℃，5%CO2加入0.3 ml 2×106/ml PBL和0.2ml培养液，0.5 ml 80μg /ml PHA和0.5 ml培养液，37℃，5%CO2培养72hr后收集细胞，用PBS离心洗涤2次，FCM备用；设组及布板如下： 三、Ta1诱导BM-MSCHOU TLR9和IDO表达： 1、 0.1ug/ml Ta1诱导BM-MSCHOU0，1，2，3，6小时，收集细胞，提取RNA后，行RT-PCR，检测TLR9的表达。 （取5瓶BM-MSCHOU，加入4 ml 培养液后，再加入4ug/ml Ta1 0.1ml，于37℃，5%CO237℃，5%CO2γ-干扰素诱导MSC，作为IDO阳性表达细胞。） 四、Ta1诱导BM-MSCSAA IDO表达： 分别用5 ug/ml 、10 ug/ml Ta1诱导BM-MSCHOU 18小时，收集细胞，提取RNA后，行RT-PCR，检测IDO的表达。 （取2瓶BM-MSCHOU，分别加入3.5 ml 、3ml培养液后，再分别加入40ug/ml Ta1 0.5ml、1ml ，于37℃，5%CO2γ-干扰素诱导MSC，作为IDO阳性表达细胞。） Thy a-1（40μg/ml）的配制： 取Thy a-1储备液（1）1600μg/ ml 0.1ml，加含10%FCS的L-MDME培养液3.9ml，即成40μg/ ml的储备液（2） 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp