提取血液dna标准规范操作规程.docxVIP

1 目的：规范提取DNA的操作流程。2 范围：适用于从抗凝血中提取DNA。3 职责：操作人员严格按照本操作规程进行血液DNA的提取。4 内容4.1 原理：红细胞裂解缓冲液（RCLB）可裂解红细胞，离心后红细胞碎片与白细胞分离。SDS是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜上的脂质与蛋白质，从而破坏细胞膜，使白细胞破碎。核裂解液（NLB）可裂解白细胞核，释放染色体，经过NaCl、氯仿抽提，可使蛋白质及脂类物质与DNA分离，再经过乙醇纯化，使一些离子等杂质与DNA分离，并促使DNA脱水析出，从而得到较纯的DNA。4.2 准备工作仪器：久保田离心机、涡旋振荡器、移液器、数显恒温搅拌循环水箱、5℃冰箱试剂：红细胞裂解缓冲液（RCLB）、NLB和SDS的混合缓冲液、6mol/L NaCl、氯仿、95﹪冷冻乙醇、75﹪乙醇、TE缓冲液4.3 操作流程4.3.1 裂解及洗涤红细胞：4.3.1.1 将冷冻的血样室温溶化，用涡旋振荡器震荡后短暂离心并分装到2.5ml冷冻管中，每个冷冻管300—450μl。将冷冻管依次编号。4.3.1.2 每管加入红细胞裂解缓冲液（RCLB）2000μl，颠倒数次后放置5分钟。4.3.1.3 将上述冷冻管对称装入离心机，10000转/分钟离心4分钟。4.3.1.4 取出冷冻管，用移液器小心吸去管中上层液体，再加入红细胞裂解缓冲液（RCLB）600μl，用涡旋振荡器将沉淀振荡混匀，使用离心机以10000转/分钟的转速离心2分钟。4.3.1.5 取出冷冻管，用移液器小心吸去管中上层液体，再加入红细胞裂解缓冲液（RCLB）600μl，用涡旋振荡器将沉淀振荡混匀，使用离心机以3300转/分钟的转速离心4分钟，弃去上层液体。4.3.2 核裂解4.3.2.1 用移液器吸取NLB和SDS的混合缓冲液270μl加入冷冻管中。4.3.2.2 再用移液器吸取NLB和SDS的混合缓冲液270μl，利用移液器吸嘴将冷冻管中沉淀刮散，再将缓冲液注入。4.3.2.3 将冷冻管置于数显恒温搅拌循环水箱中56℃水浴，根据沉淀团块大小水浴0.5—1小时。4.3.3 除杂质4.3.3.1 取出冷冻管，加入6mol/L的NaCl溶液180μl，用涡旋振荡器充分振荡混匀。4.3.3.2 加入氯仿270μl，颠倒混匀，手拿冷冻管上下剧烈震荡。4.3.3.3 将冷冻管对称装入离心机中，10000转/分钟离心2分钟。4.3.3.4取出冷冻管，用移液器吸取第一层清液，装入另外空的冷冻管中，编上相同的编号，同时估量移取清液的体积。4.3.4 纯化DNA4.3.4.1 加入2倍体积的95%的冷冻乙醇，缓慢颠倒数次至DNA析出，将冷冻管对称装入离心机中，10000转/分钟离心4分钟。取出冷冻管，用移液器吸去上清液，保留沉淀。4.3.4.2 加入与步骤4.3.4.1中相同体积的75%乙醇重悬沉淀，对称装入离心机中，10000转/分钟离心2分钟，取出冷冻管，用移液器吸去上清液，保留沉淀。4.3.4.3 重复步骤4.3.4.2。4.3.4.4 将装有DNA沉淀物的冷冻管放在操作台上自然挥发多余的乙醇溶液，或将冷冻管离心以加快DNA沉淀物的干燥速度。4.3.5 溶解DNA：向冷冻管中加入TE缓冲液120μl，振荡混匀，使其充分溶解。4.3.6 保存：将装有DNA溶液的冷冻管置于5℃冰箱冻存备用。4.4 注意事项4.4.1 步骤4.3.1.5得到的沉淀应为略带有粉红色的白色物质。若得到的沉淀大部分呈粉红色或红色，可重复步骤4.3.1.5。4.4.2 步骤4.3.2.2得到的液体若粘稠度较小，可适量再加入一些NLB和SDS的混合缓冲液。4.4.3 步骤4.3.3.1加入NaCl溶液振荡混匀后，若沉淀不明显，可再加入适量NaCl溶液，保证蛋白质充分析出。4.4.4 步骤4.3.3.4中若不小心吸入第二层（蛋白质层），可以离心后再转移上层清液到另外一只冷冻管中。5 相关文件或记录：无本页为著作的封面，下载以后可以删除本页！【最新资料 Word版可自由编辑！！员工录用管理制度为规范试用期员工的管理和辅导工作，创造良好的试用期工作环境，加速试用员工的成长和进步，特制定目标责任制制度。一、员工试用期规定?1、自员工报到之日起至人力资源部确认转正之日起。?2、员工试用期限为3个月，公司根据试用期员工具体表现提前或推迟转正。（一）、福利待遇?1、试用期员工工资根据所聘的岗位确定，核算时间从到岗工作之日起计算，日工资为：月工资÷（本月天数-休假天数）2、过节费按正式员工的1/2发放。3、按正式员工标准发放劳动保护用品。（二）、休假?1、试用期内累计事假不能超过3天，如果特殊情况超过3天需报董事长批准。?2、可持相关证明请病假，请病假程序和天数与正式员工要样。3、可请丧假，请假程序和天数与正式员工要样