基因工程菌教学讲义.ppt

质粒 宿主 检查菌落数 50代后丢失率（%） B.S.168 3821 ＜ 0.03 pKTH B.S.168 amR pap 2803 0.71 B.S.168 SacU9 1539 99.9 不同宿主对质粒稳定性的影响 3、施加选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。 1）抗生素添加法 通常在重组质粒上含有抗药性基因 AmpR AmpR TcR ? 将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后，克隆菌也获得了抗药性。 ? 在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，就可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。 但这种方法在大规模生产时并不可取, 因为： ? 成本增加 ? 对于一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素造成的选择压力只能维持一定的时间 ? 添加抗生素对结构性不稳定无能为力 ? 抗生素的存在可能会影响目的产物的合成给产物的提取带来困难 2）抗生素依赖变异法 ? 通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖型变异株——即只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长。 ? 因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能达到消除重组质粒分配不稳定性 的目的。 ? 而重组质粒上含该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。 3）营养缺陷型法 ? 通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该基因插入到重组质粒中。 ? 然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。 例如： 构建 带有色氨酸操纵子的重组质粒pBR322-trp，并在该质粒上插入SerB基因；而宿主细胞是SerB缺陷型；这样质粒与宿主形成互补，在培养过程中丢失质粒的细胞因不能合成Ser而被淘汰. 4、控制基因过量表达 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。 可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。 1）可诱导性启动子 ? 在构建表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如：lac、 trp、 PL等 ? 在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去阻遏（诱导）使质粒高效表达。 例如： 利用3-?-吲哚乙酸可使trp启动子去阻遏 2）温度敏感型质粒 一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，当温度升高到一定值时质粒大量扩增 —— 脱缰质粒 （runaway plasmid） ? 如：pKN410在30℃时的拷贝数为20～50/E.coli细胞；在35℃时质粒大量复制。 ? 将?-内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增400倍。 5、控制培养条件 ? 对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键 步骤。 ? 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3个方面尤其重要。 ? 环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。 1）培养基的组成 培养基对克隆菌稳定性的影响 （自Imanaka) 培养基 克隆菌 F20-25 不稳定型 PBB W3110trpAE1trpR tnaA 7% 结构性 MM (RSF 2124-trp) 99% 结构性 PBB W3110 trpAE1 trpRam27 12% 分配性 MM (pSC101-t