生物分离考研课件第9章节.pptVIP

第九章 电泳和电色谱; 热的产生（电泳过程主要问题）： 热扩散、对流、烧胶 凝胶电泳 √ ，自由流电泳 电泳主要用于物质的分析和鉴定，也可用于微量样品的分离纯化。 分析 √ 分离 ;9.1 基础理论 9.2 凝胶电泳 9.3 等电聚焦 9.4 二维电泳 9.5 逆向作用色谱电泳 9.6 毛细管电泳和电色谱 9.7 连续电泳和电色谱;9.1 基础理论; 根据stokes定律，球形溶质在溶液中受的粘性阻力，与速度有关 η为溶液黏度；r为球形溶质的半径；νe为溶质的运动速度 ;当电场力与黏性阻力达到平衡时， 溶质恒速泳动，其泳动速度为 或 其中 称为电解质的迁移率（mobility），是单位电场强度下的泳动速度。;b. 凝胶中的电泳速度 可避免或减小因对流或热扩散引起的分离度降低，本身还具有分子筛的作用,电泳速度与分子大小相关。 常用聚丙烯酰胺凝胶, 其他包括琼脂糖、淀粉等。 ;2. 电渗流 不动的固体或骨架电离带电，使溶剂带电，在摩擦力的作用下，泳动的离子及其水化层将带动主体溶液一起移动迁移，产生电渗流。 电渗流可驱动电色谱，与操作压力无关。 ; 按胶的形状划分： 盘状电泳和板状电泳。 板状薄片凝胶散热好，可提高电泳分辨率，在同一块胶可跑很多样品，应用比管状胶广泛。; 按凝胶的组成来划分，可分为： 连续凝胶电泳和不连续凝胶。 不连续电泳的凝胶由浓缩胶和分离胶组成，二层胶的浓度、离子强度和pH不同，电泳时样品可在两层胶间浓缩为很薄一层，可提高电泳分辨率。; 常用的不连续电泳的电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液；样品缓冲和浓缩胶的缓冲为pH6.8的Tris-HCl缓冲液；分离胶的缓冲为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。 电泳开始后，蛋白样品进入浓缩胶，浓缩胶中的Cl- 速度最快，称为快离子或先导离子；电极缓冲液中的甘氨酸进入浓缩胶后，由于浓缩胶为pH6.8，甘氨酸只有很少一部分电离为负离子，电泳速度最慢，称为慢离子或随后离子；蛋白等组分的电泳速度介???二者之间。 电泳时，快离子最快，与后面的蛋白组分间形成低离子强度的低电导区，低电导区产生高的电位梯度，促使落后的蛋白离子加速移动，赶上走在前面的蛋白分子，使样品在快慢离子间压缩成很薄的一层。; 当蛋白进入分离胶后，分离胶pH8.8，甘氨酸电离度大大增加，电泳速度加快，很快超过样品层，使快慢离子间的高电位梯度消失，此时蛋白分子处于均一电位梯度和相同pH条件下电泳进行分离。 浓缩胶的孔较大，分离胶的孔较小，蛋白分子由于二层胶孔的不同也能压缩样品的厚度。当蛋白进入分离胶时，电泳速度由于孔变小速度减慢，未进入的蛋白样品速度不变，这样减少与走在前面蛋白的距离。 ;;9.3 等电聚焦（isoelectric focusing，IEF） ; 等电聚焦的关键是形成稳定的pH梯度。 根据形成pH梯度介质的不同，梯度又分为载体两性电解质梯度(Carrier ampholytes pH gradients)或固定化pH梯度（Immobilized pH gradients）。 载体两性电解质梯度 一般在聚丙烯酰胺凝胶中加入载体两性电解质形成pH梯度。 载体两性电解质由数百至数千种不同的脂肪酸的多氨基多羧酸的异构体和同系物组成，它们具有相近但不相同的pKa和pI值，在外电场的作用下，能够形成正极为酸性，负极为碱性的连续pH梯度，缓冲能力强。 Ampholine （pH4~6、 pH8~10、 pH9~11等 ）;固定化pH梯度（Immobilized pH gradients isoelectric focusing，IPGIEF） 所用介质为一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺具有相似的聚合行为。 聚合后在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系。 聚合时形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变 IPGIEF比传统IEF具有更高分辩率，上样量更大，分辨率可