重组蛋白质分离纯化教学教材.pptxVIP

更多更快更纯——重组蛋白质的分离纯化蛋白质结构与功能研究的基本流程选择要研究的蛋白克隆表达目的蛋白分离纯化重组目的蛋白测定蛋白溶解性稳定性大量纯化表达目的蛋白核磁晶体冷冻电镜…通过各种结构生物学方法解析目的蛋白结构蛋白功能研究结构与功能的关系药物开发蛋白浓度：10-15 mg/ml蛋白纯度：95%蛋白构象均一：单体，二体，多聚体蛋白具有活性在结构生物学研究中，重组蛋白表达纯化至关重要！ ——更多更快更纯结构生物学对样品的要求 纯化策略 ——更多更快更纯实验室常用的蛋白质的 纯化方法与检测方法凝胶过滤 疏水层系 离子交换 亲和层系 反相层析检测方法： A280nm紫外吸收值； 考马斯亮蓝； SDS蛋白凝胶电泳 A280检测原理：蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量考马斯亮蓝检测原理：每个分子含有两个SO3H 基团，偏酸性，与蛋白质的碱性基团结合。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。SDS原理：聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N， N，NˊNˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。凝胶对样品分子筛效应：电场中，颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快；颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大，泳动慢。不论经过多少步纯化，最后都要根据SDS来检测蛋白的纯度！！！Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组氨酸）标签的碱性蛋白蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。Ni-NTA纯化介质是Ni离子金属螯合介质。His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。镍柱的原理与发展组氨酸 咪唑富集作用强！凝胶过滤（分子筛）纯化原理三步纯化步骤的逻辑组合蛋白纯化对于结构生物学至关重要蛋白纯化需要尝试不同的方法组合方案蛋白纯化一般采用三步纯化策略更多，更快，更纯总结