第六章固定化酶工程.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 五、动物细胞固定化 1、固定化动物细胞特点 (1) 提高细胞存活率： 动物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可以减轻或免受剪切力的影响，同时动物细胞可附着在载体表面生长，从而可显著提高动物细胞的存活率。 (2) 提高产率： 动物细胞固定化后，可先在生长培养基中繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期。以利于提高产率。 (3) 可反复使用： 固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间，利于连续化自动化生产。 (4) 易于与产物分开： 固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。 2、动物细胞固定化方法： 主要为吸附法与包埋法 (1) 吸附法： 大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面．故吸附法特别适合于动物细胞的固定化。 此法操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究和使用的方法。 常用的吸附固定化载体有转瓶，微载体和中空纤维等。 a. 转瓶吸附： 转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞容易附着在其表面生长。 培养时，转瓶以一定的速度转动。转瓶培养的设备简单，操作容易，但比表面积(S／V，表面积与体积之比值)较小，细胞的生长繁殖受到限制。若在转瓶内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加，从而提高生产能力。 b. 微载体吸附： 微载体是指颗粒细小的固定化载体．直径一般为100～200um，相对密度接近l.0。是由带有表面电荷的葡聚糖、明胶，纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。 微载体巳用于多种动物细胞的固定化；用于生产β-干扰素，人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各种疫苗等。 微载体具有很大的表面积，S／v达到150，即每1cm3的微载体其表面积达到150cm3，比转瓶的比表面积大几百倍，对细胞的生长和物质传递非常有利。缺点是固定化细胞的强度不够，容易破碎，使用时间较短。 c.中空纤维吸附： 中空纤维由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。 使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁．培养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。 这种固定化细胞与动物体内细胞的存活方式类似，中空纤维起着相当于体内微血管的作用，对动物细胞的生长和新陈代谢非常适宜． 中空纤维培养器的缺点是：中空纤维成本较高，有时会发生纤维管堵塞现象，大规模生产的难度较大。中空纤维固定化适用于动物附着细胞，也适用于悬浮细胞培养。 (2) 包埋法：包埋固定化法一般适用于悬浮细胞。根据载体和方法的不同，有凝胶包埋法、半透膜包埋法两种． a. 凝胶包埋法：利用各种多孔凝胶为载体将动物细胞固定化，细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢，由于有载体的保护，动物细胞有较好的稳定性．可显著提高其存活率。 用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等。 琼脂糖凝胶包埋法：将1～2.5％的琼脂糖加热溶化后，冷却至37～38℃，与一定量的动物细胞混和后，分散在石蜡油中。然后使温度由37℃降低至1O℃左右，得到直径为0.1～0.3mm的微球状固定化细胞。分离洗涤后可用于培养。进行单克隆抗体、白细胞介素等的生产。 海藻酸钙凝胶包埋法：将动物细胞与一定浓度的海藻酸钠溶液混合均匀，然后用注射器将混合液滴到一定浓度的氯化钙溶液中，形成直径约lmm的固定化细胞。 血纤维蛋白包埋法:将动物细胞与血纤维蛋白原混和，然后加入凝血酶。该酶将血纤维蛋白原转化成不溶性的血纤维蛋白，将动物细胞固定在其中。 b.半透膜包埋法： 利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成微囊型固定化动物细胞。半透膜的孔径可以根据需要加以控制和改变。微囊的直径为l～2mm。 制备过程：采用海藻酸钙～聚赖氨酸(ALG-PLL)包埋技术 操作时，动物细胞先用海藻 酸钙凝胶包埋．制成直径l～2mm的胶粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒