第五章 分子生物学研究方法技巧.pptx

　第五章分子生物学研究法(上)　　　5.1 重组DNA技术回顾 5.1.1 主要三大成就 1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 2. 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 3. 50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 　5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基 1、DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应 　 5.1.3 主要事件　重组DNA技术历史上的主要事件 年份事 件 1869F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T. Avery证实DNA是遗传物质。1952A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1958M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。　 1964?C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965?S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由质粒DNA所决定。1966?M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。1978?首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。　　 　1982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983?获得第一例转基因植物。1984?斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986?GMO首次在环境中释放。1988?J. D. Watson出任人类基因组计划首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--Oncomouse。1992?欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。2001完成第一个人类基因组全序列测定。5.1.4 重组DNA技术的概念重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。 基因克隆(gene cloning) 分子克隆(molecular cloning) 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。分是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA。分子克隆在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DN