第十七章 重组DNA技术讲解.ppt

（三）外源基因与载体的连接 　 　 cDNA文库 用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后， 建立的基因文库。简称 c－文库。 　　 3、cDNA文库：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（cDNA library）。 组织或培养细胞 载 体 mRNA cDNA cDNA与载体连接 导入大肠杆菌 鉴定cDNA文库的克隆数与特征 　 　 PCR是根据DNA复制的原理，在体外利用 酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA 的专门技术。 　　PCR的反应体系：模板DNA、特异性引物、 DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2＋的缓冲液。 　 　 PCR的基本反应步骤： 1. 变性：将反应系统加热至95℃ ，使 模板DNA完全变性成为单链； 2. 退火：将温度下降至50℃左右，使引 物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升至72℃ ，DNA聚合酶 以dNTP为底物催化DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25～30次循 环后，可将模板DNA扩增达百万倍。 （二）克隆载体的选择 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA 载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 1、粘性末端连接： 同一限制酶切割位点连接 配伍末端连接 （三）外源基因与载体的连接 2、平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端经特殊酶处理变为平端 3、同聚物加尾连接 由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 4、人工接头： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 （四）重组DNA导入受体菌： 受体菌条件: 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 导入方式：转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （五）重组体的筛选 重组DNA导入受体菌后，经过培 养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的 菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选 （screening）或选择（selection）。 第十七章重组DNA技术 Recombination DNA Technology 第一节 DNA的重组 DNA Recombination 一、同源重组 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 二、细菌的基因转移与重组 （一）接合作用(conjugation)：当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞（细菌）, 这种类型的DNA转移称为接合作用。 质粒：细菌染色体外的环状双链DNA分子。 　 　 质粒（plasmid） 　　是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数 千碱基对。常 有 1 ~ 3个抗药 性 基因，以利于 筛 选。 可接合质粒，如 F 因子(F factor) （三）转导作用(transduction)：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。 第二节 重组DNA技术 一、重组DNA技术相关概念 　 克隆（clone）： 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化（cloning）： 获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。 分子克隆（DNA克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。 （一）DNA克隆（也称基因克隆或重组DNA） 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工