04 蛋白质2 - 2012最新生物化学精品ppt课件.ppt

这种分离纯化方法由于专一性强，理论上可以从复杂的体系中一步提取所需的物质。 * 5. 疏水层析 6. 电泳 7. 结晶 * （五）鉴定 1．纯度鉴定 常用的方法有电泳法、超离心法等。 还有恒溶度法 * 2．分子量确定 （1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷，与蛋白质结合以后，蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。 SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。 * * （2）凝胶过滤法 原理 ： * 3．等电点的测定 * 4．生物活性的测定 不同的蛋白质有不同的生物功能，也就有不同的生物活性测定的方法。 * * 四　氨基酸分析分离 1．分配层析法的一般原理： 分配系数 Kd= CA CB CA：一种物质在A相（流动相）中的浓度 CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度 　　主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的， * 逆流分溶（逆流分配） * * 2　纸层析 单向纸层析图 Rf值 * 双向纸层析图 * 3　薄层层析 * 4　离子交换层析 原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。 这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。 　　阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H强酸型），羧基-COOH（弱酸型） 阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH- * 5　高效液相层析（high performance (pressure) liguid chromatography, HPLC） HPLC的特点: HPLC分离氨基酸的灵敏度高，可达到10-12mol水平 固相支持物颗粒小，比表面积大 溶剂系统采用高压，流速快 适于各种类型的支持物的柱层析 * （1）反相柱 （2）正向柱 HPLC常用的层析柱： * * * 1. 一级结构与功能的关系 一级结构决定空间结构 生物进化 分子病 * 天然状态，有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性 * * * 别构现象：当蛋白质表现功能时，其构象发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象就称为别构现象。 2. 空间结构与功能的关系 * 第五节、蛋白质的性质 蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨基酸相似，但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形成了大分子化合物，也就出现了一些新的性质。 * （一）胶体性质 由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质有亲水面，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。 蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。 * 蛋白质胶体颗粒的沉淀 + + + + + + + - - - - - - - + - （沉淀） （疏水胶体） （疏水胶体） * （二）酸碱性质和等电点 1. 蛋白质分子的可解离基团 2. 等电点 在某一pH值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，此时溶液的pH值就是蛋白质的等电点。 * 每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。 蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系: 等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。 * 3. 等离子点 等离子点是蛋白质在不含其它溶质的纯水中，蛋白质所带净电荷为零时的溶液的pH值。等离子点是一个常数。 4．蛋白质等电点的测定 等电聚焦 * （三）电泳(Electrophoresis) 移动的速度 v = E · Z f * (四) 变性作用（denaturation） 1．变性的概念和理论 概念：变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，使蛋白质分子原有的特定的空间结构发生改变，从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失。 理论：吴宪提出 肽链从紧密有序结构→松散无序的结构 * 2．变性的因素 物理因素: 加热、紫外线、X-射