冰冻切片基质金属蛋白酶-9原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒产.docVIP

冰冻切片基质金属蛋白酶-9原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒产品说明书 （中文版） 主要用途 冰冻切片基质金属蛋白酶-9（MMP-9）原位明胶酶谱法（in situ zymography）荧光染色试剂是一种旨在通过异硫氰酸荧光素Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-9，又称明胶酶B（gelatinase-B ）或IV型胶原酶（type IV collagenase），其前体分子量为92kDa，激活后分子量为82kDa以及更小。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤维连接蛋白（fibronectin）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白（laminin）、前体肿瘤坏死因子-α（pro-TNF-α）和白细胞介素及其受体。基质金属蛋白酶-9与肿瘤发展与转移、血管形成、斑秃（alopecia）等疾病有关。原位明胶酶谱法荧光染色（in-situ fluorescence zymography）技术在于提高基质金属蛋白酶检测的敏感性，使用异硫氰酸荧光素FITC）标记的明胶作为底物，在基质金属蛋白酶-2特异性抑制剂OA-Hy存在的情况下，经过基质金属蛋白酶-9水解后产生荧光多肽，据此在荧光显微镜下检测基质金属蛋白酶-9的活性和位置。 产品内容 胶体液（Reagent A） 毫升 底物液（Reagent B） 微升 产品说明书 1份 保存方式 保存在－20℃冰箱里， 底物液（Reagent B），严格避免光照，有效保证6月 用户自备 复染液（GMS40049）：用于样品复染 1.5毫升离心管：用于染色工作液配制的容器 盖玻片：用于样品孵育处理 微波炉：用于融化试剂 恒温水槽或培养箱：用于试剂温育或孵育反应物 荧光显微镜：用于样品染色后观察 实验步骤 实验开始前，准备好10张10微米厚的冰冻切片。同时室温下融化预热 染色液（Reagent B），避免光照。然后进行下列操作。 将 胶体液（Reagent A）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出） 小心移取微升 胶体液（Reagent A）到1.5毫升离心管 放进37℃恒温水槽孵育10分钟 同时瞬间37℃预热 染色液（Reagent B） 加入微升37℃预热的 染色液（Reagent B），混匀 （选择步骤）加入1微升用户自备的复染液 即刻分别加上40微升上述液体到未固定的冰冻切片的样品上 盖上盖玻片（注意：避免气泡） 放进4℃冰箱里孵育10分钟，或直至胶体凝结，避免光照 放进37℃培养箱里孵育60分钟，避免光照 即刻在荧光显微镜下观察：激发波长480nm，散发波长530nm――绿色荧光增强，表明基质金属蛋白酶活性高 注意事项 本产品为0次操作 操作时，须戴手套 样品准备要点如下： 冰冻切片须在8至10微米厚，且未予固定处理 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR） 如果验证样品中基质金属蛋白酶，可以使用EDTA或抑制剂预处理1小时作为对照 胶体液（Reagent A）建议使用碘化丙啶（Propidium Iodide），作为复染染料 如果样品活性过低，可以增加孵育时间至24小时 注意区分样品的自发荧光 染色参考图像如下：绿色荧光为基质金属蛋白酶；红色荧光为碘化丙啶复染