细胞培养准备工作.docVIP

一：细胞培养实验室的设备: 仪器: 倒置相差显微镜 CO2培养箱 电热干燥箱 水纯化装置 冰箱:普通冰箱(培养液,生理盐水,Hank’s液,短期保存的组织标本)和-20℃冰箱(保持生物活性及较长时间存放的制剂如酶,血清等) 液氮容器:储存细胞 离心机(4000rpm,1000rpm即可及天平 高压蒸气消毒气 滤器:Zeiss滤器,玻璃滤器,微孔滤器等。(一次性滤器：12.00×10) 消毒培养液， 血清 消化用胰酶等。 2．培养用器皿： 培养瓶：250ml,100ml（4.50×20）,25ml（3.50×10） 培养皿：10cm,9cm（3.50×10）,6cm（2.50×10）,3.5cm 多孔培养板：96孔（16.50×1），24孔（16.50×3），12孔，6孔，4孔 玻璃瓶：1000ml,500ml,250ml,100ml,50ml,25ml,5ml 吸管：刻度吸管（吸取，转移液体：1ml,2ml,5ml,10ml）（3.00×10）直头吸管（吸取，转移液体）弯头尖吸管（吹打，混匀，传代细胞） 加样器：微量加样器用于吸取，移动液体，滴加样品 其他用品：铝饭盒，橡皮吸头，胶塞，注射器，烧杯，量筒，漏斗 3．器械： 手术刀 手术剪，眼科剪（18.50） 血管钳 眼科镊（8.50），小弯头镊 钟表镊 二．培养用品的清洗和消毒灭菌： 各种类型毛刷,橡胶手套，消毒所用包装（牛皮纸，棉布，棉线等） 洗衣粉，洗涤剂 5％稀盐酸浸泡中和碱性物质 清洁液（次强液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml）需陶瓷或塑料器皿 消毒剂：75％酒精或0。1％新洁尔灭消毒皮肤，无水乙醇（用于酒精灯） 抗菌素：青霉素，链霉素 三：培养用液： 平衡盐溶液：D-HANKS液(g/l )PH试纸 Nacl 8.00, kcl 0.40, Na2HPO4.H20 0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35,酚红0.02 合成培养基：M199培养基或DMEM培养基（Gibico公司 一袋1000ml 65.00,Hepes 25g 120.00） DMEM 一袋，Hepes 3.57g,NaHCO3 2.2g,三蒸水1000ml，青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml ph=7.2~7.4 FBS胎牛血清（原代培养20％传代培养10％）(100ml 200.00) 四：组织块的分离方法： 剪切分离法：组织块在0.5mm2~2mm2内，大小影响不大（可调整翻瓶时间以保证组织块贴壁），关键在于组织块边缘整齐，光滑，要求取材迅速，动作轻柔，剥除外膜时用力适中避免机械损伤，将镊子夹过处剪去，血管纵向剖开后平铺于平皿上，手术刀片无菌，洁净，锋利，垂直下刀，力求一次切断，不要离开培养液操作，保持边缘湿润。 消化分离法：※ 胰蛋白酶法：(25g 210.00) 胶原酶法： 五：原代培养方法： 贴块法：在培养皿内将组织块剪成1mm3左右的小块，剪时可滴加1～2培养液，以保持湿润。将剪切好的小块用吸管吸入培养瓶中，均匀摆置，每小块间距0.5cm左右。轻轻翻转培养瓶，使组织块朝上，向瓶内注入少许培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在37度培养箱内。6小时后轻轻翻转培养瓶，静置培养。若组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清，胎汁。（10％胎牛血清，10％胎儿血清，0。03％ L-谷氨酰氨。110mg/l丙酮酸钠，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素） 贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。沿动脉纵轴切开后，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1-2mm2，放入加有3mg/ml胶原酶的无血清M199培养基中，37℃，0.5～1.5h。离心去上清，重复上述消化步骤，然后再离心（9000r,4min），收集细胞，在5%～10%同种血清或胎牛血清的M199培养基中调整细胞数，然后转入30～90mm培养皿中培养酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态。①种植组织块的数目，如75cm2的长颈瓶组织块不得少于30个；②根据培养细胞的种属加入适量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，应加胎牛血清（FBS），通常浓度为10%～20%0/wjf/2/course/c212.htm 相差显微镜与倒置显微镜的区别 光学倒置显微镜下观察：原代平滑肌细胞形状多样，一般常为梭形、带形、三角形或星形。贴块法培养，细胞可于2周后长成单层；而酶解离只需6～7天，镜下可见明显“峰-谷”样生长。透射电子显微镜下观察：贴块法，细胞多为合成型，肌丝减少，胞体缩小，细胞胞质内粗面内质网、游离核糖体、线粒体等亚细胞器逐渐增多。