生物化学实验（复旦大学）综合实验二 人乙醛脱氢酶2 （ALDH2）多态性分析.pptVIP

凝胶中DNA的成像 可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。 凝胶的制备及电泳 制胶 1. 准备好凝胶成型器，插入成型梳。 2. 将3 g琼脂糖加至100 ml 1×TAE缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，冷却至60℃以下。 3. 加入7 μl EB至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。 4. 将冷却的琼脂糖倒入凝胶成型器，制备凝胶。 电泳 1. 待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分钟），小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。 2. 用移液器吸取10 μl样品，小心加入点样孔。 3. 接通电源，调节电压至4-5V/cm，DNA从负极移到正极。电泳时间30－60分钟。 4. 电泳结束，关掉电源。 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平台中间; 开通紫外光，可见到发出荧光的DNA条带，在电脑中观察图像； 关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 根据图像判定结果。 结果分析 每个样品 EP管1 EP管2 结论 引物 AL1+AL3 （78bp） AL2+AL3 （73bp） 条带 出现 不出现 野生型 纯合子基因 条带 不出现 出现 突变型 纯合子基因 条带 出现 出现 杂合子基因 结果展示 DNA marker _ + A B C D E F G 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 100bp 300bp 500bp 800bp 1kbp 1.5kbp * PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ A链 B链 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 A链 B链 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 引物1 引物2 DNA引物 Taq酶 Taq酶 A链 B链 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 第1轮结束 第2轮开始 A链 A链 B链 B链 引物1 引物2 引物1 Taq酶 引物2 Taq酶 第2轮结束 A链 A链 B链 B链 第三轮PCR扩增的模板 1 原始基因： 2 第一轮扩增产物： 3 第二轮扩增产物： A链 B链 A链 B链 A链 B链 PCR产物的增长 原始基因AB链 中间产物AB链 目的片段AB链 第1轮 1 1 0 第2轮 1 2 1 第3轮 1 3 2 第4轮 1 4 4 第5轮 1 5 8 第6轮 1 6 16 …… PCR的特点 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低，血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 引物设计 引物长度以15-40 bp为宜 碱基尽可能随机分布，G+C占50-60% 引物内部避免形成二级结构 两引物间避免有互补序列 PCR的反应体系 Taq DNA聚合酶 2.5 U 4种dNTP混合物 各200 μmol/L 引物　 　 各10～100 pmol 模板DNA　 0.1～2 μg Mg2+ 　　　　　 1.5 mmol/L 模板浓度一般为100 ng/100 ?L，浓度过高会导致反应的非特异性增加 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白。 PCR反应条件 引物浓度0.1-0.5 ?mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降 Taq DNA聚合酶0.5-2.5 U/50 ?l，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量 四种dNTP浓度应相等 Mg2+ 是DNA聚合酶的激活剂，0.5 ～2.5mmol/L 基于PCR的扩增产物长度多态性（PCR-APLP） 根据已知DNA片段两端序列设计引物，一端是等位基因特异性引物，另一端是共同引物； 对已知基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增； 特异的引物配对可以扩增出某一特异基因型的片段，根据扩增出来的DNA条带大小的差异，可以分析基因型（纯合型、杂合型） ALDH2引物 AL1 5’-TAG GAC ACT CAC AGT TTT CACAT C-3’ (78bp) AL2 5’-