香蕉线条病毒侵染性克隆构建和遗传多样性分析.pdf

摘 要 香蕉线条病(Bananastreakdisease)是由香蕉线条病毒(Bananastreakvirus,BSV) 引起的一种重要的香蕉病毒病，其症状主要是在发病初期叶片和假茎部位产生连续或 不连续的褪绿条斑，随着病情发展，条斑逐渐变褐坏死，假茎、叶柄和果穗有时也会 出现条纹症状。病情严重时，会出现植株矮化，不开花或开花结果果穗小、果实不饱 满等现象。该病是由Lassoudiere于1974年首次在非洲发现，1986年由Lockhart鉴 定出其病原为香蕉线条病毒，并对该病毒进行了较为系统的研究。目前，在印度尼西 亚、印度、澳大利亚、尼日利亚、菲律宾、巴西、马达加斯加、哥斯达黎加、厄瓜多 尔、摩洛哥、乌干达、哥伦比亚及中国的台湾省等多个产香蕉国家和地区均有发生， 可导致香蕉收获期推迟，果实长度变小，香蕉束重减轻，产量减少7%--90%0 目前对香蕉病毒病的研究主要集中于遗传多样性、病毒序列的整合和检测方法等 方面。香蕉线条病毒基因组序列存在丰富的遗传多样性，各分离物间变异较大。病毒 基因组序列可整合到寄主基因组中，在一定的外界压力下，整合序列可被诱导产生游 离的病毒粒子。目前主要通过免疫捕捉一PCR法对病毒进行检测，但不同分离物的 血清学交叉反应差，导致该病的检测方法研究面临困难。 香蕉线条病在我国华南地区己有发生，可能会对我国的香蕉生产造成较大影响， 因此有必要对该病害展开全面的研究。我国香蕉品种资源丰富，可能存在多种BSV 分离物的侵染，因此应尽快了解华南产区BSV分离物的分子特征，有利于该病害的 鉴定和防治工作的开展。此外，国内外对香蕉线条病毒基因功能的研究非常少，仅局 限于根据该属病毒的基因组特征，推测BSV的基因功能。本研究通过构建BSV的侵 染性克隆，为进一步分析其基因组结构和功能奠定基础。此外，本实验中制备的 BSVGD分离物抗血清，也助于该病害的检测和BSVORFI,ORFII编码蛋白的功能 研究。具体研究方法、内容及结果如下: 1.克隆了BSVGD分离物ORFI和ORFII基因，分别将其连接到原核表达载体 pET28b(+)上，构建了原核表达重组质粒pETORFI和pETORFII，转化大肠杆菌BL21 (DE3)后，经IPTG诱导，分别产生了大小为22.8kDa和16.5kDa左右的融合蛋白。 可溶性分析表明前者以包涵体形式存在，后者为可溶性蛋白。利用其N-端的组氨酸 标签进行纯化、回收，分别获得高纯度的目的蛋白，以其作为抗原免疫健康家兔获得 这两个蛋白的专化性抗血清，间接ELISA检测的效价均达1:51200以上。检测阳性 植物组织的抗血清工作浓度分别为1:8001:3200和1:400-1:1600. 2.根据香蕉线条病毒广东分离物的基因组序列设计引物，分别克隆了病毒基因 组第6404bp-779bp和4780bp--2300bp两段序列，分别命名为BSVA,BSVT。将 BSV-A和试验室保存的BSV17同时插入克隆载体pSK，构建了重组质粒pSK-17A, 再将试验室原有的另一片段BSV12插入pSK-17A中，构建了重组质粒pSK-BSVA. 同时改造植物双元表达载体pCAMBIA-2300355，引入了XbaI和SalI两个酶切位点， 与BSVT相连，构建了PCAMBIA-T。最后把pSK-BSVA中的病毒基因组序列插引 入到pCAMBIA-T，构建了含 1.4倍病毒基因组的侵染性克隆pCAMBIA-BSV。将 pCAMBIA-BSV通过农杆菌介导分别接种巴西香蕉和本生烟，接种巧d后，本生烟 表现病毒性的花叶症状，利用PCR和试管捕捉一PCR均可以从接种的巴西香蕉和本 生烟中检侧到阳性植株，利用制备的抗血清可以从接种的巴西香蕉中检测到阳性植 株。初步证明构建的侵染性克隆具有生物学活性，可以侵染本生烟和巴西香蕉。 3.收集了来自华南农业大学园艺学院香蕉资源圃及海南、云南的34个香蕉品 种的材料，利用简并引物对香蕉线条病毒基因组中保守的复制酶区域序列进行了扩 增、克隆.测序结果经DNAStar,DNAMAN和Phylip3.63等生物学软件分析表明， 这34个BSV亚基因组片段存在丰富的遗传多样性，核昔酸同源率在 “.4%^-100.0o 之间，与已报道的8个杆状DNA病毒的系统进化树分析表明，42个Badnavir。的序 列可以分为6个组，另外寄主的基因型与病毒序列的系统进化存在一定的相关性。 关键词:香蕉 香蕉线条病毒 侵染性克隆 原核表达 遗传多样性