5氨基酮戊酸聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备及其光动力疗法抑制人皮肤鳞癌a431细胞体外增殖分析 word格式.docxVIP

增殖研究1引言552材料与方法573结果614讨论665结论706参考文献71附录76本人简历76在学期间的研究成果目录77致谢78课题综述180课题综述289中文摘要5-氨基酮戊酸聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备及其光动力疗法抑制人皮肤鳞癌A-431 细胞体外增殖研究背景皮肤癌是人类最常见的肿瘤之一，皮肤鳞状细胞癌（SCC）约占全部皮肤癌的20%。常规采用手术、激光、冷冻、放疗等直接去除或破坏肿瘤组织，存在组织结构破坏性大、易复发、复发后再次治疗困难等诸多限制。5-氨基酮戊酸光动力治疗（ALAPDT）是一种全新的治疗技术，通过光源、氧气和5-氨基酮戊酸(ALA) 的相互作用来破坏肿瘤细胞和肿瘤组织。ALA在肿瘤细胞内转换成内源性光敏性物质原卟啉IX(PpIX)，在特定波长的照射下，PpIX使氧气转换成有活性的单态氧，单态氧氧化损伤细胞器和生物分子，导致肿瘤死亡。ALAPDT的优势在于创伤性小，治疗后不影响美观、不破坏特殊部位的结构和功能，病人耐受性好，可在同一部位重复多次治疗。但是ALAPDT的缺点是治疗深度有限，在治疗深在性侵袭性皮肤SCC时疗效还不甚理想。这主要是因为给药后ALA在深部SCC组织中的浓度低、分布不均，光动力反应的效率有限。基于ALAPDT治疗机制和存在不足，我们设想开展以下两方面研究，以提高ALAPDT治疗皮肤SCC的疗效：1．提高肿瘤细胞吸收ALA转换成原卟啉IX的能力，增强光动力反应效率；2．提高ALA在组织中的渗透深度、分布的均匀性，对肿瘤的靶向选择性。因此，本研究设想通过纳米粒药物运输系统（NDDS）来提高肿瘤细胞吸收ALA转换成原卟啉IX的能力，增强光动力反应效率从而提高疗效。NDDS指的是利用纳米粒包裹运输药物。从纳米粒的安全性出发，本研究选择聚乳酸羟基乙酸纳米粒（PLGANPs）包裹运输光敏剂ALA。希望制备出5氨基酮戊酸聚乳酸羟基乙酸纳米粒（ALAPLGANPs），通过增强光敏剂ALA的稳定性、提高SCC细胞吸收ALA的效率、提高原卟啉IX的生成量，从而提高ALA的光动力反应效率。此外，纳米粒还有EPR效应（enhancedpermeabilityandretentioneffect，EPReffect），能提高ALA对皮肤SCC组织的靶向选择性。所以，我们设想通过ALAPLGANPs的应用来提高ALAPDT治疗皮肤SCC的疗效。目的通过PLGANPs装载ALA，增强PDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。包括⑴建立ALA的微量测定方法。⑵制备ALAPLGANPs并对其进行表征。⑶ 评价ALAPLGANPsPDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。方法⑴ALA的检测：采用荧光胺柱前衍生化HPLC-荧光法对ALA进行检测，以荧光胺作为荧光衍生化试剂，使用C18柱，以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（30︰70）为流动相，激发波长和发射波长为398nm和480nm。⑵ALAPLGANPs的制备和表征：采用超声-复乳法制备ALAPLGANPs。超声功率：120 w；超声时间：初乳40s，复乳40s；ALA浓度（w/v）：2.02 %，内水相（PBS（pH5））体积：0.52 ml；PLGA浓度（w/v）：7.5%，并以30%甘露醇为支架剂进行冷冻干燥。采用激光粒度分析仪测定纳米粒粒径，荧光胺衍生化HPLC-荧光法检测ALAPLGANPs的包封率、载药量、缓释。扫描电镜观察ALAPLGANPs形态，红外光谱仪测定结构，差示扫描量热仪测定物相。⑶ALA PLGA NPs PDT抑制鳞癌A431细胞体外增殖：鳞癌A431细胞与含有2.7mg/mlALAPLGANPs (相当于0.1mMALA) 无血清培养基、以及含有0.1mM ALA无血清培养基分别避光孵育4 h后采用透射电镜进行细胞形态学研究。接着，鳞癌A431细胞分别与含有2.7mg/mlALAPLGANPs、2.7 mg/mlPLGANPs以及0mM（空白对照），0.1 mM，1 mM，5mM，10mMALA的无血清培养基避光条件下共孵育，于孵育1 h，2 h，3 h，4 h，5h，6 h，8 h，12 h，14 h，16h，18h，20h，22h，24h后，测定生成的原卟啉IX荧光强度。最后，采用MTT法检测ALAPLGANPs PDT对A431细胞体外增殖的抑制作用。实验分为2.7mg/mlALAPLGANPsPDT组，0.1 mMALAPDT组, 1 mMALAPDT组，2.7mg/mlALAPLGANPs避光组，0.1 mMALA避光组，1 mMALA避光组，单纯红光组，以及阴性对照组。孵药24h后，采用635nmHe-Ne激光器（波长635nm,8J/cm2，8.6 mW/cm2）照射，再24h后MTT法观察结果。结果⑴以荧光胺衍生