50例骨肉瘤标本p53 p16蛋白表达临床研究 word格式.docxVIP

前言骨肉瘤（osteosarcoma）在我国恶性肿瘤中是最为常见的之一，骨肉瘤的恶性程度是非常高的，预后也是非常差的，它可以在几个月内就转移至肺部，手术后的5 年生存率也不超过百分之二十，约有四分之三的骨肉瘤发生在股骨远端或胫骨近端也有少部分发生在股骨近端、肱骨、髂骨、脊椎、腓骨等部位大多数的骨肉瘤为溶骨性骨肉瘤，也有少部分为成骨性的骨肉瘤。骨肉瘤的发病年龄不确定，可以在任何年龄段，大多数在十岁到二十七岁左右，骨肉瘤多发生在骨端，也有发生在骨骺或者长骨干。肿瘤的成分较多，可包括不同的软骨、骨组织和纤维组织。髓腔部位和骨膜及骨的皮质都可以出现浸润扩散。早期的骨肉瘤主要分布在骨膜下，于骨皮质融合。在溶骨性的骨肉瘤里。软骨的成分比较少，骨质的破坏很快，血管丰富，骨的坏死区域形成了包裹，并且向周围的软组织侵犯，这时可能会发生病理性骨折，小部分的骨肉瘤骨质仍比较坚硬。一般来说，骨肉瘤是不会累及关节的，只有在骨质破坏严重或者发生病理性骨折后可能会侵犯关节，因为发生的骨膜反应和骨肉瘤的进一步发展，经常可以看到骨膜隆起形成一个三角形，我们称之为考德曼（Codman）氏三角。在显微镜下我们可以看到许多形状及细胞核大小不一的肿瘤细胞，如有多个细胞核的巨细胞，还可见恶性的成骨细胞，该细胞细胞核大，染色也较其他细胞深。大部分的骨肉瘤都会胫骨血液传播到肺部，也有小部分可转移到其他内脏、淋巴结及脑部，其发生发展是一个多因素和多阶段逐步演化的过程，该过程涉及多种原癌基因的激活和抑癌基因的失活.图1 骨肉瘤患者图2骨肉瘤X片图3 病理检查P16基因失活可导致细胞获得克隆性生长优势，发生失控性生长，导致肿瘤的发生[1，2]。骨肉瘤是最早发现P53基因异常的恶性肿瘤之一。大量文献表明p53 基因改变在骨肉瘤中有很高的，郭卫等对国内情况进行报道，46例骨肉瘤中27例（58.7%）有P53蛋白高表达，国外的文献表明，p53蛋白在骨肉瘤中的改变为14%～48%，由此可以认为p53基因异常是骨肉瘤生物演化过程中的重要事件。新疆地区少数民族骨肉瘤发病率略高于汉族骨肉瘤发病率，本组应用免疫组化SP法检测免疫组化检测骨肿瘤中P53、P16蛋白的表达，探讨P53、P16基因在骨肿瘤发生、发展中的相互作用.并了解新疆汉族和少数民族P53、P16基因在骨肉瘤中表达是否存在差异。了解P53蛋白及P16蛋白是否和性别及发病部位有直接关系。材料及方法1材料标本源于新疆肿瘤医院病理科2005～2010年50例骨肉瘤蜡块，4mm 厚，进行HE和免疫组化染色。其中，男27例，女23例，年龄8～78岁，平均年龄30岁。汉族15例，少数民族35例（维吾尔族24例，回族7例，哈萨克族4例）。全部病例均经临床病史、X线和病理结合诊断。2设备、试剂及方法2.1仪器设备2.1.1设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅2.2.2试剂2.2.2.1PBS缓冲液（pH7.2～7.4）NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L.2.2.2.20.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。0.5mol/LEDTA缓冲液（pH8.0）将186.1gEDTA·2H2O溶于700ml水中溶解，用10mmol/LNaOH将溶液PH值调至pH8.0，最后加水到1000ml。1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）将121gTris碱在800ml水中溶解，用1N的HCl将溶液的PH值调至pH8.0，最后加水到1000ml。配制酶消化液（1）百分之一的胰蛋白酶液：用百分之零点一的CaCl2溶液（pH7.8）配制。（2）百分之零点四的胃蛋白酶液：用0.1N的盐酸配制。 2.2.2.配制百分之六点三的甲醇-H2O2溶液用百分之三十的过氧化氢和百分之八十的甲醇溶液配制。封裱剂（1）甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；（2）油和TBS（或PBS）配制。TBS/PBSpH9.0～9.5适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。2.2.3操作流程2.2.3.1 脱蜡和水化脱蜡前，组织芯片在必须在室温中放置一个小时或者在60℃的恒温箱中加温20分钟。（1）组织芯片置于二甲苯中放置10分钟，更换二甲苯后再放置10分钟；（2）无水乙醇中放置5分钟；（3）95%乙醇中放置5分钟；（4）70%乙醇中放置5分钟；2.2.3.2抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。抗原热修复（1）高压热修复：在已经煮沸的水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖紧不锈钢高压锅的锅盖，但不能锁定盖子。将玻片放到金属染色架上，慢慢的加压，