ags3在大鼠脑损伤过程中表达变化及作用的分析 word格式.docxVIP

目录前言 1材料和方法 3结果 11讨论 19结论 22参考文献 23综述 27攻读学位期间公开发表的论文 41致谢 42AGS3 在大鼠脑损伤过程中表达变化及作用的研究前言创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是世界范围内致残和致死的一个 公共卫生问题，可以由撞击、殴打、利器刺入等原因引起，后者损害神经系统正常解 剖及功能，从而使病患致残[1]。创伤性颅脑外伤不仅可以引起急性神经功能缺损， 而且在后续的反应性病理生理过程中，兴奋性中毒、炎症反应等会进一步引起神经系 统损伤[2-4]。脑损伤后的病理生理过程可以分为两个阶段：原发性脑损伤、继发性脑 损伤。原发性脑损伤由直接的机械暴力或者惯性力作用引起，继发性脑损伤由前者引 起的生化化学变化、细胞代谢等引起，后者可以进一步导致胶质增生、小胶质细胞活 化以及神经元凋亡等病理生理改变[5-7]。继发性脑损伤由创伤引起的神经生物化学改 变，后者进而在创伤及周边的神经组织中产生直接或间接的神经毒性作用，最终导致 创伤性脑损伤预后不良[8]。在继发性脑损伤的病理过程中，促进凋亡和抗凋亡机制 相关的细胞信号传导通路都被激活[9]。Bcl-2 和 caspase-3家族被广泛研究[10-11]。 Bcl-2家族包含抑制细胞凋亡成员（Bcl-2, Bcl-xL）和促进细胞凋亡成员（Bax, Bad） [12-13]，其中Bcl-2备受关注。在最近几十年的研究中，CREB由于其调节凋亡抑制因 子Bcl-2的转录而越来越引起关注[14]。Hiroshi Nishihara等人提出，许多cAMP激动剂可 以刺激CREB磷酸化，从而激活依赖CREB的c-IAP2的表达[15]。AGS3属于AGS家族，后者分为三个亚组：鸟嘌呤核苷酸交换因子类（I组，AGS1）, 鸟嘌呤核苷酸分离抑制因子类（II组，AGS3-6）和可以与Gβα相互作用的III组（AGS2， AGS7-10）[16-17]。先前的研究表明，在神经干细胞的发育过程中，AGS3可以与G蛋 白βα亚基结合，控制细胞有丝分裂，从而决定细胞分化命运[18]。在线虫体内，神经 细胞中的AGS3可以通过激活RIC-8改变其食物剥夺后的行为[19]。并且，AGS3基因 缺失的小鼠与正常小鼠相比，呈现出不同的代谢及心血管功能的改变[20]。在成年大 鼠吗啡戒断实验中，AGS3可以通过腺苷酸环化酶5和7激活cAMP，后者作为细胞内第 二信使，发挥复杂的生物功能[21]。尽管对AGS3的研究很多，但其在成熟中枢神经 系统中的分布及作用仍不清楚。前 言AGS3 在大鼠脑损伤过程中表达变化及作用的研究 在我们的实验中，我们观察了 AGS3 在大鼠脑损伤后表达变化，在神经细胞中的 定位，以及与细胞凋亡的关系。我们的实验为研究 AGS3 在正常脑组织中的生理功能 及在脑损伤和修复过程中的细胞分子机制提供了一个清新明亮的视野，并为临床治疗提供可能性的靶点。材料和方法材料1.1 实验动物健康雄性SD大鼠（220-270g）由南通大学实验动物中心提供。1.2 主要试剂（1）兔抗AGS3（Santa Cruz公司）（2）兔抗p-CREB（Cell signaling）（3）兔抗active caspase-3（Cell signaling）（4）鼠抗β-actin（Santa Cruz公司）（5）兔抗GAPDH（Santa Cruz公司）（6）鼠抗active caspase-3（Santa Cruz公司）（7）小鼠抗 NeuN 单抗（Chemicon 公司）（8）小鼠抗 GFAP 单抗（Sigma 公司）（9）小鼠抗 CNpase（Sigma 公司）（10） 兔抗 CD11b 单抗（ABcam 公司）（11） 辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔 IgG（Santa Cruz 公司）（12） 培养板及培养皿（6 孔、24 孔、6cm 及 10cm，美国 Corning 公司）（13） 达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeccos modified eagles medium， DMEM，美国 Gibco 公司）（14） 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国 Gibco 公司）（15） 兔血清（美国 Gibco 公司）（16） 10000 U/ml 青霉素/10000 mg/ml 链霉素（美国 Gibco 公司）（17） 0.25%胰蛋白酶（美国 Gibco 公司）（18） AGS3-siRNA （Genepharma 公司）（19） lipofectamine 2000 （Invitrogen 公司）（20） ApoScreen Annexin V kit （SouthernBiotech 公司）（2