anghv orf51和orf95基因的原核表达及多克隆抗体的制备 word格式.docxVIP

目录中文摘要IVAbstractV英文缩略表VII第一章文献综述1引言11.1 疱疹病毒21.1.1 疱疹病毒的一般生物学特性21.1.2 疱疹病毒的结构特点31.1.3 疱疹病毒感染的特点41.1.4 疱疹病毒的分类41.1.5 与鱼类相关的疱疹病毒71.1.6 鱼类疱疹病毒研究81.2 鳗鲡疱疹病毒病的研究进展101.2.1 鳗鲡生物学特征101.2.2 鳗鲡的常见病害111.2.3 鳗鲡疱疹病毒概述121.2.4 鳗鲡疱疹病毒病流行病学特征131.2.5 鳗鲡疱疹病毒病的诊断141.2.6 鳗鲡疱疹病毒病的防治151.2.7 鳗鲡疱疹病毒的基因组161.2.8 鳗鲡疱疹病毒的结构蛋白17第二章AngHV-FJORF51、ORF95 基因的克隆及序列分析192.1 实验材料192.1.1 试验细胞、病毒、菌株192.1.2 主要试剂192.1.3 主要仪器与设备202.2 试剂的配制202.3 实验方法212.3.1 细胞的复苏222.3.2 EO细胞的传代22AngHV-FJ的细胞扩繁22病毒DNA的提取232.3.5 引物的设计、合成232.3.6 ORF51和ORF95 基因的PCR扩增232.3.7 凝胶电泳242.3.8 基因片段的回收纯化242.3.9 大肠杆菌感受态细胞的制备252.3.10 目的基因与pMD19-Tvector连接262.3.11 转化272.3.12 质粒DNA提取272.3.13 酶切鉴定282.3.14 序列分析282.4 结果与分析292.4.1AngHV-FJ的扩繁292.4.2 引物设计、合成302.4.3 目的基因的扩增312.4.4T克隆的鉴定312.4.5 ORF51和ORF95 基因序列分析322.4.6 ORF51和ORF95 蛋白序列分析332.5 小结40第三章AngHV-FJORF51、ORF95 在大肠杆菌中的表达413.1 实验材料413.1.1试验菌株、质粒413.1.2 主要试剂413.1.3 主要仪器与设备423.2 试剂的配制423.3 实验方法443.3.1 表达质粒的构建453.3.2 蛋白的诱导表达453.3.3 蛋白表达条件的优化463.3.4 蛋白的WesternBlot 检测473.4 结果与分析473.4.1 表达质粒的构建483.4.2 ORF51蛋白的诱导表达483.4.3 ORF95蛋白的诱导表达493.4.4 重组蛋白表达条件的优化503.4.5 表达蛋白的WesternBlot检测523.5 讨论54第四章AngHV-FJORF51、ORF95 蛋白的纯化及多克隆抗体的制备564.1 实验材料564.1.1 实验动物564.1.2 实验试剂564.1.3 实验仪器574.2 试剂的配制574.3 实验方法574.3.1 ORF51 蛋白的纯化584.3.2 ORF95蛋白的纯化584.3.3 蛋白浓度的测定604.3.4 多克隆兔抗血清的制备604.3.5 间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗体的效价614.4 结果与分析614.4.1 ORF51蛋白的纯化614.4.2 ORF95蛋白的纯化624.4.3 ORF51 蛋白兔抗血清效价的测定634.4.4 ORF95 蛋白兔抗血清效价的测定644.5 讨论64第五章结论65参考文献:66致谢72攻读硕士学位期间发表的论文73中文摘要鳗鲡是福建省的优势水产养殖品种，其产值在水产品进出口贸易中占有重要地位。但是，鳗鲡养殖过程中病害的频繁发生和流行给业者造成了巨大损失，严重阻碍了产业的健康发展。本人所在的实验室成功从收集的鳗鲡病料中分离出一株鳗鲡病毒，通过电镜形态学观察、分子生物学检测等手段对分离的病毒进行鉴定，确定其为给多国鳗鲡养殖业造成巨大损失的鳗鲡疱疹病毒（AngHV），这也是我国大陆首次分离出该病毒。AngHV是具有囊膜的线性双链DNA病毒，基因组全长248.5Kbp，包含136个独特的开放阅读框（ORFs）。Beurden等对AngHV-1 的结构蛋白进行鉴定以及定位，结果显示，ORF51和ORF95为AngHV-1的主要结构蛋白。因此，ORF51和ORF95有可能会成为制备基因工程疫苗的候选基因。本文选择ORF51和ORF95两个基因进行研究，主要取得以下研究结果：1.对ORF51和ORF95基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析，结果显示ORF51基因不含保守结构域，其编码蛋白含有跨膜区、不含信号肽；ORF95基因含保守结构域，其编码蛋白含有跨膜区和信号肽，ORF95蛋白与传染性鲑鱼贫血病毒（ISAV）血凝素酯酶蛋白（HA）有关联，可能参与病毒的吸附和出膜。.设计引物，克隆了AngHV-FJ ORF51和ORF95两个基因，并利用