半自动生化分析仪教程.pptVIP

5.3 固定时间法 指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也称此法为两点法。该种方法有助于解决某些反应的非特异性问题。 5.4 连续监测法 目前，酶浓度测定有两种方法，两点速率法和多点速率法，它是测定酶所催化的反应速度，间接计算出酶的含量。在酶促反应过程中，不是任何时期的反应速率都和酶浓度成正比。当酶促反应刚一开始，底物处于过量状态，酶与底物开始结合，生成复合物，底物浓度开始下降，此时产物尚未生成。当复合物分解，生成产物，酶促反应速度急骤上升，经过很短的作用时间后，产物的生成量或底物的减少量与反应时间成线性关系，反应速度保持恒定不变，这一时期称为零级反应期。 随酶促反应继续进行，底物不断消耗，酶促反应条件逐渐变化，酶促反应速度逐渐减慢，产物生成或底物减少量的变化曲线遂趋平坦，这一时期称为一级反应期。此时的反应速率常常不能准确反映酶的含量，只有当底物饱和度时，酶促反应速度才能保持恒速，此时的酶促反应速度和酶浓度才有线性关系。 生化分析仪是由微机控制的恒温比色，并记录酶促反应全过程的仪器，因此采用连续监测法来测定酶活性，大大提高了测定的准确性和分析速度。连续监测法是通过适当的仪器，连续测定（每2~30秒监测一次）酶促反应过程中产物或底物的浓度随时间变化的情况。在反应速度恒定期，以单位时间酶反应初速度来计算酶的活力单位。 5.5 波长的选择 5.5.1 波长的正确选择有利于提高测定的灵敏度和减少测定误差。 光度学方法有单波长和双波长之分，有的仪器可用三波长，多波长以及两波长比率等。有的仪器可作导数光谱分析。单波长测定易受样品溶血、黄疸、脂浊等因素干扰。双波长分析就是选择主波长同时选择副波长，在计算时用主波长的吸光度减去副波长的吸光度。双波长的优点：①消除噪音干扰。②减少杂散光影响。③减少样品本身光吸收的干扰。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，双波长方式可以部分消除这类光吸收干扰。 5.5.2 测定波长选择有三个主要条件 ①待测物质在该波长下的光吸收最大。②其吸收峰宜较宽而纯，而不是处于尖峰或陡肩，一般不选光谱中的末端吸收峰，换句话说，该吸收峰处的吸光度随波长变化较小。③常见干扰物在该波长下的光吸收最小。试剂盒说明一般已提供波长参数。实际波长选择需要了解待测物质和干扰组分对不同波长单色光的吸收程度，即以波长为横坐标、吸光度为纵坐标作吸收光谱曲线（光吸收曲线）。 六、分析仪的质量控制 ①建立各项目的标准操作程序。 ②室内质控和结果分析。 ③参加全国或地方的室间质量评价的活动。 6.1 校准 6.1.1 校准方法 6.1.1.1 用校准品进行校准：用校准品进行校准应注意如下问题：选择合适的校准品，以保证检测结果的可溯源性；根据试验项目确定校准的频度，校准的频度过高，加重不必要的工作及浪费资源，同时易引入系统偏差；校准的频度过低，不能保证结果的准确性。室内质控出现异常的趋势或者偏移时的项目应重新校准；注意区别定值质控血清和校准品，决不可用定值质控血清代替校准品进行校准。 校准方式可采用两点或多点校准，但对于多数的免疫比浊法应采用多点校准。校准方式可采用两点或多点校准，但对于多数的免疫比浊法应采用多点校准。两点法校准采用一个浓度的校准品和一个试剂空白，标准曲线为直线；多点法校准工作曲线可以为对数、指数、量程法等非线性曲线。 6.1.1.2 应用实际K值进行校准 迄今为止，某些仪器还是用理论K值或者厂家给出的K值进行计算。一个物质的摩尔吸光度是一个定值，而理论K值的计算与物质的摩尔吸光系数、光径、样本及试剂加注量等因素有关。在不同的检测系统，由于仪器的性能不一，特别是仪器的加样系统的误差、分光系统的误差、干涉滤光片或光栅等半波宽度偏大导致的杂光以及多波长同时使用等，使仪器达不到理论上的最佳状态，从而导致该仪器的实际K值与理论K值不一致。 因此，不宜直接使用理论K值进行计算。如果使用厂家配套的检测系统，厂家提供的K值实际上是该检测系统的实际K值，在仪器经厂家校准的前提下，可以直接使用。 6.1.1.3 在公认的酶活性标准品问世前需使用K值进行酶活性的计算。应提倡使用实际K值进行计算。使用实际K值应注意如下问题：不同的仪器，实际K值不同；同一仪器的不同时期，特别是仪器进行了维修甚至更换了重要的部件时，实际K值不同；不同的检测系统，实际K值不同。 6.1.2 标准物质（参考物质）的特征 6.1.2.1 均质性好：在使用标准物质时常是取其中一部分，而标准物质的标示值是对一批标准物质定值的数据，因此均匀性好是标准物质使用的重要特征。如冻干血清复溶混匀前飞溅、悬浮性颗粒（如全血细胞校准物和质控物）混匀方法