雌激素通过其核受体介导的notch信号通路对子宫内膜癌细胞增殖活性的影响-妇产科学专业论文 word格式.docxVIP

细胞冻存：将培养瓶中的细胞用胰酶消化，吹打均匀，吸至离心管中，1000rpm离心 2min。弃去上清，加入适量冻存液，分装入冻存管中，每支 1．5ml。将冻存 管放入 4℃冰箱冷藏 30min，移入一 20℃冰箱冷冻 30min，移入-80℃冰箱冷冻一天， 然后移入液氮罐中长期保存。实验分组：1. 雌激素对Notch表达及细胞增殖活性影响的剂量效应分析，分为6组：空白对 照（control,添加PBS）；10-11M组（添加E2，其工作浓度为10-11mol/l）；10-10M组；10-9M 组；10-8M组；10-7M组。2.雌激素及Notch信号通路抑制剂（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-Lalanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester, DAPT）对Notch 表达及细胞增殖活性的影响，分为4组：空白对照组(添加PBS)，E2组(添加E2，其终 浓度经试验筛选为10-9M)；DAPT组(添加DAPT，其工作浓度为10μM)；E2+DAPT 组(添加E2及DAPT)。3. Ishikawa细胞中雌激素及ERα抑制剂（ICI182780）对Notch表达及细胞增殖活 性的影响，分为4组：空白对照组(添加PBS)，E2组(添加E2，其工作浓度为10-9M)； ICI组(添加ICI182780，其工作浓度为10 μM)；E2+ICI组(添加E2及ICI182780)。4. KLE细胞中过表达 ERα后雌激素对Notch表达及细胞增殖活性的影响，分为4 组：空白对照组(添加PBS)，E2组(添加E2，其工作浓度为10-9M)；PER组(过表达ERα)； E2+PER组(过表达ERα后添加E2)。MTT法收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 200ul 铺板使待测细胞调密度1000- 10000 个/孔，边缘孔用无菌 1×PBS 填充，5%CO2，37℃孵育，至细胞贴壁。细胞用无血清的培养基静止培养 24 小时后，加入各组相应药物处理 48 小时，每孔200ul，设 6 个复孔。96 孔板细胞接种：1) PBS 清洗培养皿中的细胞 3 次，用胰蛋白酶消化汇合的单 层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。2) 离心细胞悬液，使细胞沉积下来。用 培养基重悬细胞，计数。3) 根据实验分组用加样器在平底 96 孔板中间六列（3-8） 六行（每组做 5 个副孔）的各孔中加入细胞悬液，使每孔中的细胞数为 2000 个； 周边加 PBS 作读板仪的空白对照。4) 用含 10%血清的 DMEM 培养基将各孔的培养液补齐到 200μl。每孔加入 20ul MTT 溶液（5mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4 小时后，小心 吸去孔内培养液，每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10min，使结晶 物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔即空白组（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相 同浓度的药物溶解介质、培养基、MTT、二甲基亚砜）。最后比色以空白调零。RT-PCR细胞总RNA 抽提： 所用试剂及器具均经去RNase 处理。取药物处理24小时后的Ishikawa和KLE细胞，弃去培养皿（6孔板）中的培养基， 加入Trizol（1 ml/孔），吹吸数次，室温静置5min至细胞完全融解，并将培养皿中的 液体全部移至1.5ml的EP管中；相分离：每管加入氯仿300μl，盖紧管盖，剧烈摇荡15 s，使Trizol和氯仿充分混 匀，并在室温下孵育3 min，在4℃下离心，12,000 rpm，15 min。离心后，混和液分 成三层：底层的酚-氯仿层，中间层以及上层无色的水相。RNA 即存在于水相中， 水相的体积约为所加Trizol 体积的60%；RNA 沉淀：转移水相约300μl至新的EP管，加入约700μl异丙醇与水相混匀，使 总体积至1ml。在室温下孵育10-20分钟，在4℃下离心，12,000 rpm，10 min。离心 后，在试管底部可看到一胶样团块，即为沉淀的RNA；RNA 的洗涤：移去上清，保留沉淀的RNA 团块，用1ml无水乙醇洗涤一次， 将乙醇与RNA 团块混匀，在4℃下离心，12,000 rpm，5 min；RNA 的溶解：吸去乙醇后，将RNA 团块在空气中干燥5-10 min，待完 全干燥后，溶解于DEPC 处理过的双蒸水中；定量：用紫外分光光度仪测量RNA 的浓度C及A260/280 的比值； 质量的检测：将提取的RNA 在0.8%琼脂糖凝胶电泳（80 V，30 min），检查18S和28S带的存在。细胞cDNA 的制备：用1 μg 总RNA 进行反转录。首先在无RNA酶的EP 管中加入：总RNAX μl