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第二章 酶工程 酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，是在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。它的应用主要集中于食品工业、轻工业、医药工业和环保等领域。 （3）对酶生产菌的要求 　1）不是致病菌，也不产毒素 　2）不易变异退化，不易感染噬菌体 　3）产酶量高，而且最好产生胞外酶 　4）原料廉价，周期短，易培养 2.酶生物原料预处理(酶的提取） 胞外酶：直接从发酵液中提取； 胞内酶：需破碎细胞。 破碎细胞的方法： ①动植物细胞常用高速组织捣碎机和组织匀浆器破碎； ②微生物细胞的破碎则有机械破碎法、酶法、化学试剂法和物理破碎法等多种。??? （1）酶分离的沉淀技术（粗分级） 1）盐析———溶解度的差异 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl]，当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（salting out）。 盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，复可溶解。 盐溶—盐析 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？ 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？ 2）PEG沉淀法———溶解度的差异 　　　空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。 PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。PEG沉淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。 室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却至0℃以下，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。 4）等电点沉淀法——溶解度的差异 蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 一般用于酶的粗分离。 5）热变性沉淀法——热稳定性的差异 适用于热稳定性酶。通过控制T，使大量杂质蛋白变性除去。 可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。 （2）层析分离(细分级） 是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数）的不同，使各组分的分布程度不同而达到分离。 1）凝胶过滤层析：分离酶蛋白时，分子大小大于凝胶孔径的蛋白被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小分子蛋白质则可自由出入凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的分子蛋白就被分开了。 2）离子交换层析法 原理:不同蛋白质等电点不同,在同一pH介质中电离情况不同，分子所带电荷不同,与离子交换剂的吸附能力不同. 将离子交换树脂装入层析柱。 带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质. 离子交换层析的基本原理 3） 亲和层析法 原理：利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。 将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除去。被结合的物质再用洗脱剂把它从柱上洗脱下来。 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 4） 高效液相色谱层析（HPLC） 特点： 　①使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。 ②溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。 在蛋白质组学中对电泳的分类 一维电泳(one dimensional gel electrophoresis, 1DE)，现在普遍采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)，又称双向电泳 一维电泳 现在普遍采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），包括非变性电泳(native PAGE)和SDS两种， 前者主要是在分离蛋白复合物时经常用到。 迁移率由分子大小、分子形状、净电荷多少决定。 后者SDS（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳） 在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二