缺氧通过ampk调控肌原细胞分化机理的初步研究和肌原细胞中igf2调控pgc-1α机理的初步研究-生药学专业论文 word格式.docxVIP

缺氧通过AMPK调控肌原细胞分化机理的初步研究和肌原细胞中IGF2调控PGC-1α机理的初步研究摘要(1)缺氧是整个机体或局部机体失去了足够氧气供应的一种情况，当组织细胞得不到充足的氧气，或不能充分利用氧气时，如贫血、肺换气不足和肺部纤维瘤，组织的代谢机能，甚至形态结构都可能发生异常变化，特别是影响机体的氧化供能。生物有机体为了应对缺氧胁迫，形成了一系列的缺氧应答机制，最终使细胞、组织乃至整个生物体都能够在氧气浓度不足的情况下满足能量代谢、生物合成等需要。骨骼肌祖细胞能够对缺氧做出应答。发育及运动中的骨骼肌往往处于缺氧环境中，而许多骨骼肌相关的疾病也表现出缺氧特征。缺氧能够抑制肌原细胞的分化，这提示在发育中缺氧的微环境中或骨骼肌重塑的过程中，氧气依赖的信号通路能够抑制祖细胞的分化，直至有足够的氧气供应，但其确切机制并不完全清楚。研究证实缺氧能够通过激活缺氧诱导因子HIF-1抑制Akt的活性，最终导致了肌原细胞分化能力减弱，而AMPK 作为机体氧化压力的感受器，能被缺氧所激活，激活的AMPK通过抑制mTOR信号通路参与了缺氧应答，这提示我们，AMPK也可能参与了骨骼肌的缺氧应答。本研究旨在探明缺氧条件下AMPK信号通路以及Akt信号通路参与C2C12肌原细胞分化的机理，探明骨骼肌缺氧应答的作用机制。研究结果显示，缺氧能抑制C2C12肌原细胞分化为多核的肌管细胞；同时在缺氧条件下的分化过程中，AMPK蛋白被激活，AMPK的抑制剂CompoundC能够营救缺氧抑制的细胞分化，因此缺氧抑制肌原细胞分化依赖AMPK。通常AMPK激活会抑制其下游mTOR的活性，而mTOR已经被证实参与了肌细胞的分化，因此我们检测了mTOR的两个靶蛋白S6K1和4E-BP1的活性，发现缺氧以及AMPK活性改变没有引起肌细胞mTOR通路变化。之前的研究证实缺氧通过激活HIF抑制了Akt 活性，从而抑制了肌原细胞的分化，是否AMPK激活与Akt活性相互关联？结果表明，抑制AMPK活性导致缺氧条件下Akt的磷酸化。哺乳动物AMPKα有两个亚型α1、α2，我们分别构建了siRNA干扰AMPKα1、AMPKα2载体，结果显示，分别敲降AMPKα1、AMPKα2均导致缺氧条件下Akt的磷酸化，说明AMPKα1、AMPKα2均抑制了Akt活性。以上结果表明缺氧导致了AMPK激活，而激活的AMPK抑制C2C12细胞的Akt的磷酸化。为了进一步明确AMPK是如何抑制Akt活性的，我们检测了Akt上游的接头蛋白IRS1的活性，发现在缺氧条件下，IRS1Ser789的磷酸化上调，而AMPK的抑制剂可以下调其磷酸化。研究已经证实IRS1的Ser789磷酸化后，IRS1活性降低，因此，推测缺氧条件下激活的AMPK能够通过磷酸化IRS1Ser789抑制其活性，从而抑制了其下游的PI3K/Akt信号通路，导致分化受抑制。本研究明确了能量感受器AMPK参与肌原细胞的分化，初步证实AMPK通过抑制Akt活性抑制细胞分化。这一结果丰富了我们目前对缺氧导致肌原细胞分化抑制的认识，从分子水平上为治疗肌肉损伤再生性等疾病提供了理论依据。(2)胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowthfactors;IGFs)在生长发育中的骨骼肌以及成人骨骼肌的重塑过程中都起着重要的作用。IGF2是一种胚胎肌肉发生的调节因子，并且是肌原细胞体外分化的自分泌起始因子。IGF2对骨骼肌的发育至关作用，而且在成人骨骼肌的再生和肥大等生理病理过程中也扮演着重要的角色。PGC-1α是机体能量代谢重要的感受器和调节器，因而它在能量代谢高的器官和组织含量丰富，以维持机体对能量的需求。PGC-1α不仅对骨骼肌的能量代谢有十分重要的作用，也与肌肉相关的疾病有关。但骨骼肌中PGC-1α的调控机制还不完全清楚。本研究旨在探明IGF2通过PGC-1α调节肌肉的能量代谢来调节骨骼肌的生长发生等过程，有利于进一步为治疗肌肉营养失调和肌肉代谢疾病提供一定的理论依据和指导意义。基于以上研究目的，我们进行了一系列的实验。结果显示，在小鼠C2C12肌原细胞中，外源性的IGF2能够下调PGC-1α的mRNA表达及转录活性。PI3K/Akt 的抑制剂LY294002能够营救被IGF2下调的PGC-1αmRNA的表达。为进一步研究PI3K/Akt调节PGC-1α的机制，我们构建了FoxO1磷酸化位点突变的突变体FoxO1-3A。FoxO1是PGC-1α的转录因子，并且能够被Akt在三个位点磷酸化后出核，因而抑制了其转录因子的功能，导致其靶基因转录水平的下调。我们将FoxO1-3A突变体转染C2C12细胞发现，IGF2不能够下调过表达FoxO1-3A突变体的C2C12细胞的PGC-1α，这项结果表明了Akt能够磷酸化PGC-1α的转录因子使其出