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染色体或间期核玻片标本制备 探针制备和标记 玻片标本的变性 探针的变性 原位分子杂交 荧光显微镜观察 染色体或间期核玻片标本制备 直接法制备 短期培养法 72小时培养法 探针制备和标记 标记方法： 间接标记: 生物素 地高辛 直接标记： 荧光素 单一序列基因探针（单标、双标） 染色体着丝粒探针 染色体涂色探针 CGH M-FISH Rx-FISH 白血病的染色体异常： 染色体数目异常的检测 染色体结构异常的检测 易位 倒位 FISH在白血病中的应用: 白血病的MICM诊断---常见染色体易位的检测 鉴别标志染色体,发现、确定新的染色体易位，有助于定位克隆新的疾病基因 白血病疗效判断,鉴定BMT后造血细胞的克隆起源 白血病预后判断,检测微小残留病和监测早期复发 单一基因探针 单标记FISH inv (16) M4Eo 单一基因探针 双标记FISH t (15;17) M3 (APL) t (8;21) M2b t (9;22) CML 染色体着丝粒探针 检测染色体数目异常 染色体定位标记 着丝粒及着丝粒周染色体易位 全染色体涂抹 (Chromosome painting) COBRA M-FISH Chrom FITC TRITC 1 100 0 2 67 33 3 50 50 4 33 67 5 0 100 M-FISH基本原理（2） 光谱核型分析（SKY） * * 常规细胞遗传学/ FISH 在白血病诊断分型中的应用 - 上海血液学研究所 陈冰 细胞遗传学基础 常见染色体异常——数目异常 单倍体： n 多倍体： 3n或4n 非整倍体： 单体：monosomy 三体：trisomy * 非整倍体：有丝分裂中染色体不分离或染色体丢失 常见染色体异常——结构异常 缺失： deletion 重复： duplication 易位： translocation 等臂染色体： isochromosome 常见染色体异常——结构异常 环状染色体： ring chromosome 标记染色体： marker chromosome 双着丝粒染色体： dicentric chromosome 双微体： double minutes 白血病细胞遗传学研究方法——标本来源和采集 骨髓： 3-5ml ； *取自肿瘤组织本身 外周血： (1) WBC10x109/L; (2) 原、幼细胞百分比10% *分裂相均来源于白血病细胞 *无脂肪颗粒，标本质量好 淋巴结： 穿刺液或活检标本 *骨髓浸润时可用骨髓标本 白血病细胞遗传学研究方法——染色体制备方法 直接法： 不经培养立即处理 短期培养法：按1-3x106/ml细胞密度接种到培养基 培养24-48h 同步法： 应用MTX或Fdu处理17h，使其同步化 白血病细胞遗传学研究方法——染色体显带 Q带： 荧光很快褪色，标本不易保存 C带： 染色体着丝粒显带，对染色体识别帮助不大 G带： 带纹细致，解象力强 末端呈浅带，不利于该区异常的识别 对分裂相数量及质量要求高，条件欠稳定 *盐水法、碱处理法、尿素法、蛋白酶消化法 *AT碱基呈深带 R带： 带型与Q、G带相反 除Y染色体外，末端均呈深带，揭示该区的缺失与易位 方法简便，重复性好，可成批显带 对分裂相量少质差的肿瘤细胞显带成功率高 带纹不如G带精细，难以识别微小异常 *荧光R带、热处理Giemsa-R显带法 *CG碱基呈深带 核型分析的优缺点: 直观，能同时检测全部染色体数目、结构异常 为形态学检查，灵敏度有限 必须有可分析的中期分裂相，无法分析间期核 染色体荧光原位杂交技术在肿瘤遗传学研究中的应用 FISH的基本原理： 单链DNA（探针）和与其互补的DNA（玻片上的标本）退火杂交 Denature Hybridization FISH的基本步骤： FISH的基本步骤（1）： FISH的基本步骤（2）： FISH探针的选用： 一、经典的FISH技术 FISH探针的选用： FISH探针的选用： FISH探针的选用： FISH探针的选用： FISH检测的优点（1）: 直观，是细胞遗传学和分子生物学之间的桥梁 敏感性和特异性高 能分析一部分显带技术不易分辨的异常， 如某些倒位、丢失、复杂畸形等 FISH