第四部分 分子系统学.doc

第四部分 分子生物学在系统学中的运用 分子系统学(molecular systematics)是检测、描述并解释生物在分子水平的多样性及其演化规律的学科，是一门综合性很强的交叉学科。其理论基础来源于系统学、分类学、遗传学、比较生物化学、分子生物学和进化论，其方法来源于免疫学、仪器分析、生物化学和分子生物学。它是随着PCR技术、限制性内切酶等现代生物学技术的诞生及其在系统学中的应用和发展而形成的，经过几十年的发展，分子系统学逐渐形成了自身的原理和分析方法。1 实验数据的获取 进入NCBI主页(/)后，在Search框中选择nucleotide，在For后输入Grylloidea complete mitochondrion，即蟋蟀总科全线粒体后，点击Go即可搜索出符合条件的序列。在搜索结果中浏览已经测序的蟋蟀总科全线粒体基因组，发现该总科已经被测序的有5种。点开每一种的序列号，即可得到全线粒体基因序列及相关信息。 本研究所选择的5种蟋蟀总科及外群全线粒体基因序列数据的分类地位及来源见表2-1。所用线粒体基因组主要来自于截止2012年3月为止GeneBank中收录的所用蟋蟀总科昆虫。以NCBI中收录的东方蝼蛄(Gryllotalpa orietalis)和斑蝼蛄（Gryllotalpa pluvialis）作为外群。 2实验数据处理和分析 所下载的种昆虫的全线粒体基因序列所编码的基因完全相同，均为ATP6,ATP8,COX1,COX2,COX3,CYTb,ND1,ND2,ND3,ND4L,ND4,ND5,ND6。将表2-1中所列的线粒体基因组编码的13个蛋白编码基因分别作为一个独立的Fasta格式文件。用ClustalX1.83进行多重序列比对，参数设置均设置默认。将比对好的13种蛋白编码基因分别建成个数据集。 (1) 序列组成分析 经ClustalX 1.83软件比对后的序列为aln格式，在MEGA中打开并转化为meg格式，在使用MEGA 4.1软件进行比对结果的分析。计算各个种之间的遗传距离(及其标准差)，各数据组碱基的组成(nucleotide composition)、保守位点(conserved sites)、变异位点 (variable sites)、简约信息位点 (parsimony information sites)、自裔位点(singleton sites)、两两碱基频率(nucleotide pair frequency)、转换与颠换的比值R(Ts/Tv)等。并进行碱基组成偏向性分析和碱基替换饱和性分析等。 所有进化模型均假设各支系的碱基组成处于平衡状态，所以在数据分析之前，需要对数据组的碱基组成偏向性(base composition bias)进行检验。 (2) 数据组系统发育信号检测 如果转换颠换比的值小于2.0此基因序列的突变已达到饱和状态，可能会发生多重替换，受进化噪音影响的可能性较大，给系统发育分析带来困难，因此要对各数据集进行碱基替换饱和分析。 3 系统发育分析软件 分子生物之形质资料与一般传统形态形质资料之性质不同，故在计算生物间的相似度的方法或系数种类亦不同，特别需考虑sequence alignment的问题，而并非单纯或直接去比对各形质之异同。 1. ClustalX 2.0：用来对核酸与蛋白序列进行多序列比较（multiple sequence alignment）的软件。多序列比较在分子生物学中是一个基本方法，用来发现特征序列 ，进行蛋白分类，证明序列间的同源性，帮助预测新序列二级结构与三级结构，确定PCR引物，以及在分子进化分析方面均有很大帮助。 2. PHYLIP（Ver. 3.68）：Phylogeny Inference Package，内含三十余种独立程序可分析各种类型之资料及选用不同的分析方法。它可以分析DNA与蛋白序列，限制位点等，并可绘制进化树。程序含有许多选项可以精确控制与分析。 3. TreeView 1.6.6：TreeView是用来生成与打印进化树的软件它可以读取NEXUS与PHYLIP生成的进化树格式文件，生成进化树，并输出到打印机。 4. PAUP 4.0b（Win）：PAUP是由Swofford所编写的利用简约分析进行系统发育分析（phylogenetic analysis using parsimony）的软件包，目前亦有多个版本。该软件包中提供了简约分析用的多种模型，其中包括了Wangner、Fitch、Doll、Camin-Sokal等，对系统发育分析结果亦可进行一些统计分析及自举检验。PAUP具有IBM-PC和Macintosh两种文本供选择。 5. MEGA 4.1：分子进化遗传分析MEGA（molecular evolutionary gen