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chapter 9 研究基因、基因组的结构 内容 基因定位的方法 DNA测序技术 研究基因组的结构 1 基因定位的方法 小分子上的定位 大分子上的定位 1.1 小分子上的定位 EcoR I酶切R6-5，利用凝胶电泳分离酶切片段。 将DNA转移到纤维素膜上或尼龙膜上 对重组DNA分子标记，与酶切片段进行杂交。 这样就可以将kan抗性基因定位于R6-5的限制性酶谱上。 从凝胶上转移DNA分子的方法是1975年由E. M. southern 发明的，称为southern转移. 转移技术用于RNA，称为northern转移。 蛋白质转移，western 转移。 1.2 克隆的基因在大分子上的定位 大于250kb的DNA分子 经典遗传学的方法进行连锁分析。 凝胶电泳分离染色体 原位杂交定位基因 染色体步移 1.2.1 凝胶电泳分离染色体 普通的电泳，不能分离大于50kb的分子。 正交交变电场凝胶电泳（orthogonal field alteration gel electrophoresis, OFAGE）。 OFAGE可以分离几千kb的分子。 CHEF(contour clamped homogeneous electric fields) and FIGE(field inversion gel electropherosis) 分子超过50 000kb，上述技术也无法进行分离。 1.2.2 原位杂交定位基因 将细胞固定于载玻片上。 利用核酸酶降解RNA, NaOH使DNA变性。 标记克隆的基因，克隆的基因与染色体进行杂交，放射性自显影后产生黑点，就显示出了基因在染色体上的位置。 也可以用荧光探针，这需要用到特殊的显微镜。使用不同的荧光染料，可以同时标记两个或多个不同的基因，通过颜色来区别，这种技术称为荧光原位杂交。 1.2.3 染色体步移(chromosome walking) 利用不同的酶建立两个不同的基因文库，比如EcoR I和BamHI。 从文库A中将已知的基因钓出来，然后用来与文库B杂交。 然后再用获得的克隆杂交文库A，也可能获得一个到多个文库。重复多次杂交，建立部分的内切酶图谱，直到找到所要寻找的基因。 步移最大的距离时200-250kb。成功的报道很多，如人类的囊肿性纤维化疾病基因 2 DNA测序—揭示基因的结构 在1970s末，高效、快速的测序才成为可能，主要有两种技术： 链末端终止法—由F. Sanger和AR Coulson发明 化学降解法—A Maxam and W. Gilbert发明 2.1 链末端终止法 引物结合 合成互补链 四种不同的体系产生了四种不同末端的系列片段 分离不同的片段 判读DNA序列 2.1 链末端终止法 判读DNA序列 定位最远的片段 依次读出各个片段的末端碱基 一次可以测定400bp的片段 2.2 化学降解法 标记双链DNA的5’端，然后加入二甲基亚砜并加热到90°C，使双链DNA分子变成单链。 通过凝胶电泳分离两条链，其中一条链含有更多的嘌呤成为重链，另一条链为轻链。 纯化两条链，分成四份，分别利用不同的降解试剂进行降解（哌啶,氮杂环己烷），产生了一系列的降解片段。 2.4 DNA测序的成就 1975年完成了ΦX174噬菌体的5386bp片段的序列测定。 1977年，测定了SV40病毒5243bp的序列。 1978年测定了pBR322 4363bp的序列。 1981年Sanger报道了人类线粒体基因组16.6kb序列1982年λ噬菌体49kb。 目前10-20kb的测序已经是非常普遍了。人类基因组计划的促进了测序的飞速发展，现在已经能对完整的染色体进行测序如Saccharomyces cerevisiae。 2005年454公司首推划时代的新一代测序仪，从而引发了测序市场上454、Illumina、ABI等公司在新一代测序技术上的比拼高潮。也正是这种你追我赶，让绘制人类全基因组图谱由过去的耗费4.37亿美元和13年时间，骤然缩短到如今SOLiD?3运行一次即获得20GB可定位测序数据，相当于人类基因组的7倍覆盖度，费用也有望降低至1万美元。各种测序公用数据库极大地推进了分子领域的研究进程，重要性不言而喻。 3 比较基因组学 X-ray film reading * ATGCGGATCTAGACT * * * * 4 reaction tubes A T G C A T G C A T G C 自动测序仪 DNA序列分析的自动化 DNA芯片测序仪 Building up a long DNA sequence from a series of short overlapping