实验三 血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定(七年制)教程文件.ppt

* * 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 刘晓如 【实验目的】 1．学习盐析法、凝胶层析和离子交换层析分离纯 化蛋白质的基本原理及应用 2．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用 3．了解蛋白质分离纯化的总体思路 【实验方法】 一、盐析法粗分γ-球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度 【基本原理】 蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。 不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下，带电的情况等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。 分离蛋白质的方法 分离方法 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电学法 电泳法 等电聚焦 超速离心法 离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析 在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。 【基本原理】 本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析方法，分离纯化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度。 实验思路 分段盐析去除杂蛋白 凝胶层析脱盐 交联葡聚糖吸水浓缩 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 先粗后细 离子交换层析纯化 盐析步骤 取离心管一支加入血清 2ml 加入2ml 0.9%氯化钠摇匀 边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml 上清液（主要含清蛋白）倾去 静置10min，再离心（5000转/分）10min 沉淀用1ml 0.9%氯化钠搅拌溶解 逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀 静置10min，再离心（5000转/分）10min 倾弃上清液（主要含α、β球蛋白） 沉淀即为初步纯化的γ－球蛋白 加入0.0175mol/L磷酸缓冲液（pH=6.3)1ml溶解 γ－球蛋白 粗提液 二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐 欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法： 凝胶层析法、透析 本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。 凝胶层析原理：P31 凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。 凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时，直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。 凝胶层析法脱盐 凝胶柱层析脱盐 数学模型 Vo Vi Vt Vi—凝胶孔内水（内水） Vo—颗粒间水（外水） Vg—凝胶体积 总体积Vt= Vi +Vo+Vg Kd — 分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数 Ve—洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积 Kd=(Ve-Vo)/Vi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度/吸光度为纵坐标作图 （1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0 （2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，0Kd1 （3）完全渗透的小分子，Ve=Vo+Vi， Kd=1 ▲ Sephadex G-25的准备 ▲ 装柱（15~20cm） 操作步骤： 1、层析柱保持垂直。 2、放蒸馏水，排出空气，关闭出口。 3、加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，调节流速10滴/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm。 4、上留1-2mm的水，关闭出口。 注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。 ★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。 ▲ 加样与洗脱 ▲ 凝胶的再生 1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品 溶液渗入凝胶。 2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收 集洗脱液，每管收集1ml。用奈氏试剂检测NH4+。 3、保存：20%璜基水杨酸溶液检测洗脱液的蛋白质，保存 含量高的进一步纯化 不断加洗脱液，使NH4+全部流出，为下次实验做准备 脱盐 1